ZDZISŁAWA LIBUDZISZ
MIKROBIOLOGICZNE I TECHNOLOGICZNE ASPEKTY PROBIOTYKÓW

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka, 
Institute of Fermentation Technology and Microbiology, Technical University of Lodz

Probiotykami nazywamy żywe mikroorganizmy, które w postaci preparatów farmaceutycznych lub dodane do żywności, korzystnie wpływają na organizm gospodarza poprzez poprawę równowagi jego ekosystemu jelitowego. 
Przewód pokarmowy zdrowego człowieka jest zasiedlony przez około 1014 komórek mikroorganizmów reprezentujących aż 400-500 różnych gatunków. Mikroflora ta kolonizuje  blisko 200-400m2 powierzchni nabłonka jelitowego. Najliczniejsza populacja zamieszkuje jelito grube, gdzie stanowią około 40-50% jego treści (29, 30).  Układ jakościowy i ilościowy mikroflory jelitowej zawiera dominującą przewagę mikroorganizmów korzystnych dla jego zdrowia i jest dość stabilny. Pożyteczna rola wielu grup mikroorganizmów przewodu pokarmowego polega ponadto na uczestniczeniu w trawieniu pokarmów spożywanych przez człowieka, syntezie niektórych witamin, rozkładzie substancji toksycznych, w tym również niektórych substancji rakotwórczych czy prekursorów substancji rakotwórczych. Niektóre mikroorganizmy przewodu pokarmowego zdolne są do stymulacji systemu immunologicznego człowieka. Bakterie endogenne przewodu pokarmowego są ponadto konkurencyjne w stosunku do mikroorganizmów chorobotwórczych.
W typowej mikroflorze zdrowego, dorosłego człowieka liczbowo dominującymi są gatunki bakterii z rodzaju Bacteroides, stanowiące około 1011 komórek/g treści jelit. Poza nimi znajdują się również w dużych ilościach bakterie z rodzajów Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Escherichia czy Clostridium. Liczba tych bakterii, zależnie od gatunku, sięga od 5x108 do 1010/g kału (Rys.1). Stanowią aż 99% biomasy jelit człowieka. Są to bakterie względnie lub bezwględnie beztlenowe, fermentujące źródła węgla z wydzieleniem różnego rodzaju niskocząsteczkowych kwasów tłuszczowych (SCFA).  Produkują również wiele związków istotnych żywieniowo dla człowieka (11, 17, 29, 30).  Liczebność dominującej mikroflory u poszczególnych ludzi jest jednak znacząco zróżnicowana (tab. 1).
Ekosystem jelitowy człowieka może ulegać zmianie, a nawet zniszczeniu, jako wynik leczenia chemioterapeutykami, pod wpływem radioterapii, infekcji wirusowych czy bakteryjnych. Układ mikroflory jest także determinowany warunkami środowiskowymi, stanem zdrowia, stresem psychicznym oraz cechami osobniczymi człowieka. Bardzo istotny wpływ wywiera również rodzaj diety i jej stan mikrobiologiczny (rys.  2). Drobnoustroje chorobotwórcze dostające się do przewodu pokarmowego wraz ze spożywaną żywnością lub w efekcie nieprzestrzegania warunków higieny (Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, enterpatogenne szczepy Escherichia coli czy niektóre gatunki Bacillus i Clostridium) mogą rozmnażać się lub nawet zasiedlać błony śluzowe jelit, powodując różnego rodzaju zatrucia pokarmowe. Tworzą ponadto metabolity toksyczne dla człowieka oraz enzymy, które mogą być odpowiedzialne za powstawanie substancji kancerogennych lub przekształcanie substancji prokancerogennych w kancerogenne. Liczba mikroorganizmów chorobotwórczych w przewodzie pokarmowym zdrowego człowieka jest z reguły niska, kontrolowana przez pozostałe mikroorganizmy  i nie stanowi istotnego zagrożenia dla jego zdrowia. 
Tak liczny i różnorodny zespół mikroorganizmów jelitowych człowieka prezentuje ogromny potencjał katalityczny w organizmie, którego aktywność może nieść zarówno korzyści jak i może stanowić zagrożenie dla zdrowia. 
Jako niezmiernie ważne dla poprawy zdrowia człowieka, oddziałujące zatem na niego probiotycznie, uznaje się bakterie fermentacji mlekowej. Zmniejszony udział tych bakterii w przewodzie pokarmowym powoduje u ludzi różne objawy, począwszy od uczucia wzdęcia do poważnych kłopotów trawiennych, stanów chorobowych przewodu pokarmowego i wreszcie do pogorszenia stanu zdrowia człowieka. 
Podstawy naukowe, takich stwierdzeń, położył jednak dopiero w pierwszych latach XX wieku, laureat nagrody Nobla, Ilia Miecznikow. Miecznikow dowodził, że obecność bakterii mlekowych w przewodzie pokarmowym, w odpowiednio wysokiej liczbie, korzystnie działa na zdrowie gospodarza. Efekt ten jest wynikiem regulacji składu mikroflory jelitowej. Od tego czasu obserwuje się rozwój badań charakteryzujących zespół mikroflory jelitowej człowieka i jej wpływu na zdrowie, jak również rozwój produkcji nowych wyrobów zawierających korzystne dla zdrowia bakterie lub substancje stymulujące ich rozwój. 
Do bakterii mlekowych zaliczamy gramdodatnie ziarniaki oraz pałeczki z rodzajów Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Enterococcus,Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella. Ze względu na produkcję kwasu mlekowego i podobne środowiska występowania do bakterii mlekowych ostatnio zalicza się również rodzaj Bifidobacterium. Bakterie fermentacji mlekowej stanowią więc niejednorodną diagnostycznie grupę, której wspólną cechą jest zdolność beztlenowej fermentacji sacharydów. Bakterie te wykorzystują zarówno cukry proste, disacharydy jak i niektóre oligo- i polisacharydy jako źródła węgla. W wyniku fermentacji produkują od 0.6 do 3% kwasu mlekowego. Zależnie od gatunku bakterii, ale również od warunków hodowli, wytwarzają kwas L(+) lub D(-) mlekowy. Kwas L(+) mlekowy, jako identyczny z powstającym w mięśniach, jest w pełni metabolizowany przez człowieka. Bakterie mlekowe tolerują jednocześnie niskie pH (ok. 3-4 jednostki). Optymalne temperatury ich wzrostu wynoszą 20-28oC (gatunki mezofilne) i 37-45oC (gatunki termofilne). Naturalnym środowiskiem występowania bakterii mlekowych poza przewodem pokarmowym człowieka i zwierząt są rośliny, mleko oraz błony śluzowe jamy ustnej i dróg rodnych.
Bakterie fermentacji mlekowej są szeroko wykorzystywane w wytwarzaniu żywności fermentowanej, nadając produktom specyficzny smak i aromat oraz, dzięki produkcji tzw. substancji antagonistycznych, chronią go przed rozwojem mikroorganizmów zanieczyszczających surowce, w tym również patogennych. Te konserwujące właściwości bakterii mlekowych są znane od tysięcy lat i wykorzystywane  przez człowieka. Surowcami do produkcji żywności fermentowanej mogą być warzywa, mleko, mięso jak i różne owoce. 
Modyfikację (wzbogacenie) mikroflory jelitowej w kierunku bakterii korzystnie oddziałujących na organizm człowieka powinno się prowadzić poprzez stosowanie odpowiednich preparatów lub produktów żywnościowych zawierających żywe bakterie probiotyczne, szczególnie bakterie fermentacji mlekowej należące do rodzaju Lactobacillus  i Bifidobacterium.
Bakterie z rodzaju Lactobacillus obejmują 103 gatunki, z których grupa acidophilus, casei, paracasei, rhamnosus jest charakterystyczną dla jelit i stąd stanowią doskonałe szczepy proponowane do składu preparatów i produktów probiotycznych. 
Rodzaj Bifidobacterium zawiera 32 gatunki, pogrupowane w oparciu cechy metaboliczne i oryginalność ekologiczną. Są to mikroorganizmy występujące głównie w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. W organizmach ludzi bytuje naturalnie 14 gatunków tych pałeczek. Bifidobakterie stanowią główną, a nieraz jedyną mikroflorę jelitową niemowląt karmionych tylko mlekiem matki i znaczną część drobnoustrojów zasiedlających jelito grube ludzi starszych. 
Liczba bfidobakterii w jelicie grubym wynosi średnio 1.6x1010 komórek, jednak zależnie od człowieka może się wahać od 8104 do 2.51013.  Ilość bakterii z rodzaju Lactobacillus jest tylko nieznacznie niższa i wynosi średnio 4109, w wahaniach od 4104 do 3.21012 komórek (4, 9). Udział ilościowy tych bakterii w ekosystemie jelitowym jest więc bardzo zmienny i często nie wystarczający dla zapewnienia właściwego układu ekosystemu jelitowego. 
Nie wszystkie jednak bakterie mlekowe należące do tych rodzajów wywołują w organizmie człowieka jednakowo nasilony efekt poprawy zdrowia. Właściwości te są bowiem związane ze szczepem, a nie gatunkiem bakterii. Poszukiwania i badania w wielu ośrodkach naukowych doprowadziły do pozyskania zaledwie kilku (kilkunastu) szczepów probiotycznych, o udokumentowanych klinicznie właściwościach. Kryteria ich selekcji obejmują aspekty bezpieczeństwa, funkcjonalne i technologiczne. Bezpieczeństwo szczepu jest określone jego pochodzeniem, brakiem powiązania z kulturami chorobotwórczymi oraz profilem oporności na antybiotyki. Aspekty funkcjonalne dokumentują ich zdolność przeżycia w przewodzie pokarmowym, działanie immunomodulacyjne, korzystny efekt w mutagenezie kałowej. Szczepy probiotyczne muszą spełniać ponadto wymagania stawiane przez technologie ich produkcji oraz być zdolne do przeżycia i zachowania swoich uzdolnień podczas przechowywania i dystrybucji gotowego wyrobu. Listę najcenniejszych kultur probiotycznych zamieszczono w tabeli  3. Szczepy te stosowane są już w wielu krajach jako dodatki do żywności lub jako preparaty farmaceutyczne. 
Udokumentowano w licznych badaniach naukowych (3, 12, 18, 20, 21, 24, 26, 31), że szczepy probiotyczne przywracają naturalny, właściwie funkcjonujący układ mikroflory jelitowej, hamują rozwój wielu mikroorganizmów chorobotwórczych, zmniejszają częstość występowania biegunek podróżnych, łagodzą przebieg i skracają czas trwania niektórych biegunek bakteryjnych i wirusowych (np. wywołanych przez Clostridium difficile, Shigella, Salmonella, enterotoksyczne szczepy Escherichia coli czy rotawirusy), zapobiegają wystąpieniu lub łagodzą przebieg biegunek poantybiotykowych, zmniejszają nasilenie biegunek popromiennych, likwidują lub zmniejszają objawy nietolerancji laktozy, działają hipocholesterolemicznie, mogą działać leczniczo w encefalopatii wątrobowej, a także normalizują zaburzenia motoryki jelit u ludzi w podeszłym wieku. Interesujące są także badana dokumentujace antagonizm bakterii probiotycznych w stosunku do Helicobacter pylori, bakterii związanej z powstawaniem wrzodów żołądka i dwunastnicy (2, 10).
Bakterie probiotyczne wspomagają specyficzne i niespecyficzne mechanizmy obronne człowieka i zwierząt. Badania wykazały, że dzienne wzbogacenie diety w 109-1012 komórek bakterii probiotycznych już po kilku tygodniach może spowodować wzrost liczby naturalnych komórek bójczych w surowicy krwi, zwiększyć aktywność makrofagów i limfocytów. Stwierdzono ponadto zwiększenie poziomu interferonu g i immunoglobuliny A w surowicy krwi. Pojawiły się również informacje dokumentujące, że immunomodulacyjne działanie bakterii mlekowych może dodatkowo zmniejszać reakcje uczuleniowe u ludzi. Wyjaśnia się to zjawisko wzrostem produkcji interferonu g, który przeciwdziała syntezie immunoglobulin E, aktywnych w reakcjach alergicznych (12). 
Mechanizmy aktywności przeciwnowotworowej bakterii mlekowych wynikają z hamowania w jelitach rozwoju bakterii syntetyzujących enzymy katalizujace przemiany prekursorów związków kancerogennych do kancerogennych, a także metabolizowania bądź wiązania (usuwania) związków rakotwórczych pochodzących z diety lub tworzonych przez bakterie chorobotwórcze w jelitach (19). Udokumentowano ponadto, że bakterie mlekowe zdolne są do wykorzystywania (wiązania) nitrozoamin i niektórych innych substancji mutagennych, np. azobarwników, mikotoksyn czy pirolizatów aminokwasów (1, 15). W badaniach na zwierzętach wykazano także, że mogą hamować rozrost niektórych komórek nowotworowych, np. nowotworu puchliny brzusznej, mięsaka Sarkoma oraz białaczki.
Szczepy bakterii probiotycznych, aby mogły w stanie żywym dotrzeć do jelit i spełnić tam swoją korzystną rolę, muszą być odporne na wysoką kwasowość soku żołądkowego i obecną w dwunastnicy żółć. 
Ze względu na rosnącą świadomość roli układu mikroflory jelitowej dla zachowania zdrowia człowieka obserwuje się w  ostatnich latach bardzo intensywny rozwój produkcji nowych rodzajów żywności fermentowanej,  zarówno pochodzenia zwierzęcego (mleko fermentowane bakteriami probiotycznymi) jak i roślinnego. Żywność taka jest kwalifikowana do żywności funkcjonalnej, zatem wnoszącej poza efektem odżywczym korzystny wpływ na określone funkcje organizmu, prowadząc do poprawy stanu zdrowia i dobrego samopoczucia człowieka lub redukowania ryzyka zachorowania. 
W rozpatrywaniu terapeutycznych wartości probiotycznych produktów żywnościowych należy jednak pamiętać, że musi zawierać dostateczną liczbę żywych i aktywnych komórek w chwili spożycia. Dla żywności funkcjonalnej przyjmuje się minimalną liczbę żywej mikroflory probiotycznej wynoszącą 105-106 komórk/ml lub g; wykazano bowiem, że dla uzyskania wyraźnych efektów zdrowotnych niezbędne jest minimalne spożywanie ok. 108 - 109 komórek żywych mikroorganizmów dziennie w mleku fermentowanym (11). 
Badania kliniczne dotyczące korzystnego działania produktów probiotycznych dla zdrowia człowieka są obecnie bardzo intensywnie prowadzone w wielu krajach, w tym również w międzynarodowych projektach badawczych. Wyniki tych prac są publikowane w renomowanych czasopismach naukowych i powinny w pełni wyjaśnić mechanizmy działania bakterii probiotycznych.
Wykorzystanie wiedzy na temat zespołu mikrobiocenozy przewodu pokarmowego, udokumentowanie w nim korzystnej funkcji bakterii probiotycznych nabiera coraz większego znaczenia w uprzemysłowionym świecie, szerzących się tzw. chorobach cywilizacyjnych i starzejących się społeczeństwach.  Spożywanie coraz większej ilości żywności wstępnie przygotowanej (tzw. „fast food”), zawierającej często zbyt dużo tłuszczy, a za mało warzyw jest również niewątpliwie czynnikiem, który niekorzystnie modyfikuje zespół mikroflory jelitowej człowieka.
 	W przetwórstwie mleczarskim szczepy bakterii probiotycznych wprowadzane są do składu tradycyjnych szczepionek przeznaczonych do produkcji napojów fermentowanych, serów twarogowych czy też lodów i mrożonych deserów, bądź też stanowią wyłączną mikroflorę odpowiedzialną za proces fermentacji. Najwięcej badań i nowo opracowanych technologii z użyciem szczepionek jelitowych obserwuje się dla mlecznych napojów fermentowanych. 
	Mleczne napoje fermentowane otrzymane w wyniku fermentacji z udziałem szczepów jelitowych określane są jako nietradycyjne (non-traditional) lub nowe (nowej generacji) mleczne napoje fermentowane (new fermented milks). W przypadku zastosowania bakterii jelitowych łącznie ze szczepionkami tradycyjnymi otrzymane w wyniku fermentacji nowe produkty fermentowane przyjęto kwalifikować jako napoje II generacji, natomiast produkowane wyłącznie z wykorzystaniem szczepów jelitowych jako napoje III generacji (5, 7, 28).
	Szczególnie intensywny rozwój produkcji nowych napojów fermentowanych jest obserwowany w ostatnim dziesięcioleciu, i produkty tego typu, zależnie od kraju stanowią od kilku do kilkudziesięciu procent produktów fermentowanych (14, 25, 32) . Nazwy tych napojów  mają z reguły aspekt komercyjny, podkreślający zdrowotne wartości takich produktów. Przedrostki „Bio-” są aluzją do naturalnego pochodzenia produktu (Biojogurt, Biodrink, Biogarde, Biokys, Biobest i inne), przedrostek „Sano” odnosi się do zdrowia (Sanoyogurt), „Acti-” produkt o określonej aktywności (Actimel, Actifit) lub też mają na celu zaznaczenie rodzaju mikroflory, która w tym produkcie jest odpowiedzialna za fermentację (mleko acidofilne, mleko bifidusowe itp.).
	Warunkiem wartości zdrowotnej takich produktów jest obecność żywych, o udokumentowanych cechach probiotycznych, bakterii Lactobacillus  lub Bifidobacterium na poziomie nie niższym niż 106 komórek/ml.
	Produkty fermentowane bakteriami jelitowymi mają inny smak niż napoje tradycyjne, są łagodnie kwaśne i zazwyczaj o niezdecydowanym aromacie. Takie cechy organoleptyczne mogą być nieakceptowane przez konsumentów, dlatego też często koryguje się smak poprzez dodatek ziół, aromatów, dosładzanie, jak również zwiększając zawartość suchej masy mleka. W najnowszych produktach fermentowanych proponuje się dodatek odpowiednich, tzw. prebiotycznych sacharydów, np. laktulozy, fruktooligosacharydów czy galaktooligosacharydów, selektywnie stymulujących rozwój bifidobakterii w przewodzie pokarmowym. 
Nie ma w tej chwili już wątpliwości, że mikroflora jelitowa i jej pożądana modyfikacja z wykorzystaniem preparatów i produktów probiotycznych może chronić przed schorzeniami jelitowymi oraz może wpływać na ogólną poprawę zdrowia gospodarza.
Nie ma również wątpliwości, że niektóre sacharydy poprzez stymulację wzrostu bakterii probiotycznych mogą odgrywać istotną rolę w funkcjonowaniu przewodu pokarmowego, a szczególnie jelita grubego. Spożywanie żywności probiotycznej i prebiotycznej może więc zabezpieczyć człowieka, przynajmniej częściowo, przed wieloma, tzw. chorobami cywilizacyjnymi oraz poprawić kondycję ludzi w podeszłym wieku.
	Oceniając zachowanie konsumentów zauważa się wyraźne trendy spożywania żywności, która jest korzystna dla zdrowia, można zatem rokować, że produkty nowych generacji w  najbliższych latach staną się dominującymi na rynku napojów fermentowanych.

Literatura
1.	Burns A.J., Rowland I.R.: Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics. Curr. Issues Intest. Microbiol., 2000, 1, 13-24
2.	Coconnier M.-H., Lievin V., Hemery E., Servin A.L.: Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 4573-4580
3.	Crittenden R.G.: Prebiotics. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 141-156
4.	Cummings J.H.: The large intestine in nutrition and disease. Ed. by the Institute Danone, 1997, 1-155
5.	Drissen F.M.: New technologies for fermented milks. Bulletin IDF No 277, 1992,  4-16
6.	Dunne C., Murphy L., Flynn S. i wsp.: Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models and in human clinical trials. Antonie van Leeuwenhoek, 1999, 76, 279-292 
7.	Fooks L.J., Fuller R., Gibson G.R.: Prebiotics, probiotics and human gut microbiology. Int. Dairy J., 1999, 9, 53-61
8.	Holzapfel W.H., Schillinger U.: Introduction to pre- and probiotics. Food Res. Int. 2002, 35, 109-116
9.	Hunger W., Peitersen N.: New technical aspects of the preparation of starter cultures. Bulletin IDF No 277, 1992, 17-21
10.	Kabir A.M.A., Aiba Y., Takagi A., Kamiya S., Miwa T., Koga Y.: Prevention of Helicobacter pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model. Gut 1997, 41, 49-55
11.	Kleessen B., Bezirtzoglou E., Matto J.: Culture-based knowledge on biodiversity, development and stability of human gastrointestinal microflora. Microb. Ecol. Health Dis., 2000, 12, suppl. 2, 53-63 
12.	Koebnick C., Wagner I., Ising K., Stern U.: Die Wirkung eines probiotischen Getranks auf gastrointestinale Symptome und das Befinden von Patienten mit chronischer Obstipation. Ernahrungs-Umschau, 2001, 48, 392-396
13.	Lee C.H., Salminen S.: The coming age of probiotics. Trends  Food Sci. Technol., 1997, 6, 241-245.
14.	Lourens-Hattingh A., Viljoen B.C.: Yogurt as probiotic carrier food. Int. Dairy J., 2001, 11, 1-17
15.	McCracken V.J., Gaskins H.R.: Probiotics and the immune system. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 85-112
16.	O`Brien J., Crittenden R., Ouwehand A.C., Salminen S.: Safety evaluation of probiotics. Trends Food Sci. Technol., 1999, 10, 418-424
17.	O`Sullivan M.G., Thornton G., O`Sullivan G.C., Collins J.K.: Probiotic bacteria: myth or reality? Trends Food Sci. Technol.,  1992, 3, 309-314
18.	Pathmakanthan S., Meance S., Edwards C.A.: Probiotics: A review of human studies to date and methodological approaches. Microb. Ecol. Health Dis., 2000, 12, suppl. 2, 10-30 
19.	Rafter J.: The role of lactic acid bacteria in colon cancer prevention. Scand. J. Gastroenterol., 1995, 30, 497-502
20.	Reid G.: Testing probiotics in clinical trials. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 129-140
21.	Rolfe R.D.: The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. J. Nutr. 2000, 130, 396S-402S
22.	Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J., Mattila-Sandholm T.: Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotechnol., 2000, 84, 197-215
23.	Salminen S.: Uniqueness of probiotic strains. Nutr. Newsletter  IDF No 5, 1996, 18-19
24.	Salminen S., Ouwehand A., C., Isolauri E.: Clinical application of probiotic bacteria. Int. Dairy J., 1998, 8, 563-572
25.	Sanders M.E., Huis in`t Veld J.: Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues. Antonie van Leeuwenhoek, 1999, 76, 293-315
26.	Sanders M.E.: Consideration for use of probiotic bacteria to modulate human health. J. Nutr. 2000, 130, 384S-390S
27.	Saxelin M., Korpela R.: Lactobacillus GG products with clinical documentation. Nutr. Newsletter  IDF 1996, No 5, 35
28.	Tamime A.Y., Marshall V.M. & Robinson R.K.: Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria. J. Dairy Sci., 1995, 62, 151-187
29.	Tannock G.: A fresh look at the intestinal microflora. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 5-14
30.	Tannock G.W.: Studies of the intestinal microflora: a prerequisite for the development of probiotics. Int. Dairy J., 1998, 8, 527-533 
31.	YCIMR, Yakult Central Institute for Microbiological Research (red.): Lactobacillus casei strain Shirota – intestinal flora and human health. Yakult Honsha Co., Ltd., Tokyo, 1999, 1-288
32.	Ziemer J.C., Gibson G.R.: An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspectives and future strategies. Int. Dairy J., 1998, 8, 473-479 

Tabela 1. Liczebność dominującej mikroflory przewodu pokarmowego człowieka (wg 32)

Mikroorganizmy		Zakres (log liczby kom./g s.m.)	
Bacteroides 
Eubacterium
Bifidobacterium
Clostridium
Lactobacillus
Ruminococcus
Peptostreptococcus
Peptococcus
Streptococcus (beztlenowe)
Methanobrevibacterium
Desulfovubrio	9.2-13.5
5.0-13.3
4.9-13.4
3.3-13.1
3.6-12.5
4.6-12.8
3.8-12.6
5.1-12.9
7.0-12.3
7.0-10.3
5.2-10.9	

Tabela 2. Kryteria doboru szczepów probiotycznych (wg 7, 8, 16, 22)

Kryterium	Wymagane właściwości	
Bezpieczeństwo	Pochodzenie od ludzi
Izolowany z przewodu pokarmowego zdrowych osobników
Historia bezpiecznego stosowania
Brak informacji o powiązaniu z chorobami infekcyjnymi serca lub przewodu pokarmowego
Brak zdolności rozszczepiania kwasów żółciowych
Brak działania ubocznego
Brak genów oporności na antybiotyki zlokalizowanych na elementach niestabilnych	
Funkcjonalność	Konkurencyjność w stosunku do mikroflory zasiedlającej ekosystem jelitowy
Zdolność do przeżycia, wzrostu i aktywności metabolicznej w miejscu przeznaczenia
Odporność na sole żółci (możliwość przeżycia w jelitach) 
Odporność na kwasowość soku żołądkowego
Konkurencyjność w stosunku do blisko spokrewnionych gatunków
Aktywność antagonistyczna w stosunku do patogenów, takich jak Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Helicobacter pylori
Odporność na bakteriocyny, kwasy i inne związki antagonistyczne produkowane przez endogenną mikroflorę zasiedlającą ekosystem jelitowy
Adherencja i zdolność kolonizacji określonych miejsc w organizmie człowieka, lub odpowiednio długi czas przeżycia	
Przydatność technologiczna	Łatwość produkcji dużej ilości biomasy, wysoka produktywność hodowli
Odporność na procedury utrwalania starterów (zamrażanie, liofilizacja, przechowywanie)
Żywotność i stabilność pożądanych cech bakterii w czasie przygotowania i dystrybucji produktów probiotycznych
Wysoka przeżywalność przechowalnicza bakterii w gotowym produkcie
Zapewnienie pożądanych cech organoleptycznych gotowych produktów
Odporność na bakteriofagi
Genetyczna stabilność	

Tabela 3. Szczepy o właściwościach probiotycznych (modyfikowane wg 6, 23, 27)

Szczep 	Efekty zdrowotne (badania kliniczne)	
Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53 013)
	Kolonizacja przewodu pokarmowego, ochrona przed biegunkami po antybiotykoterapii, leczenie i zapobieganie biegunkom rotawirusowym, leczenie powracających biegunek spowodowanych przez Clostridium difficile, ochrona przed ostrymi biegunkami, leczenie choroby Crohna i dziecięcego artretyzmu reumatoidalnego, właściwości antagonistyczne w stosunku do bakterii wywołujących próchnicę zębów	
Lactobacillus casei Shirota
 	Ochrona przed zaburzeniami jelitowymi, leczenie biegunek rotawirusowych, utrzymywanie w równowadze mikroflory jelitowej, obniżanie aktywności enzymów fekalnych, ochrona przed mutagenami pokarmowymi, pozytywne efekty w leczeniu raka pęcherza moczowego, wspomaganie układu odpornościowego we wczesnych stadiach raka okrężnicy	
Lactobacillus casei 
DN 114 001	Stymulacja układu odpornościowego, zapobieganie i leczenie infekcji jelitowych, dobra przeżywalność w żołądku i dwunastnicy, zmniejszenie częstości i skrócenie czasu trwania ostrych biegunek u dzieci;   	
Lactobacillus acidophilus 
NCFB 1748	Obniżenie aktywności enzymów fekalnych, zapobieganie biegunkom po radioterapii, leczenie obstrukcji	
Lactobacillus johnsonii La1 (NCC533)	Stymulacja układu odpornościowego, adhezja do komórek ludzkiego jelita, pozytywne efekty w leczeniu nieżytów przewodu pokarmowego	
Bifidobacterium breve Yakult	Ochrona przed mutagenami pokarmowymi, utrzymanie w równowadze mikroflory jelitowej, ochrona przed biegunkami	
Bifidobacterium bifidum	Leczenie biegunek rotawirusowych, utrzymanie w równowadze mikroflory jelitowej	
Lactobacillus gasseri ADH	Obniżenie aktywności enzymów fekalnych, dobra przeżywalność w przewodzie pokarmowym 	
Lactobacillus acidophilus 
NCFM	Obniżenie aktywności enzymów fekalnych, dobra przeżywalność w przewodzie pokarmowym 	

                       
                   Szkodliwy wpływ                                                             Korzystny wpływ
                na zdrowie człowieka                        12                     na zdrowie człowieka                                                                              

               
Bacteroides 

                              Eubacterium

Produkcja toksyn, substancji kancerogennych, szkodliwych enzymów;

Hamowanie szkodliwych mikroorganizmów, działanie immunomodulacyjne, obniżenie aktywności metabolicznej;

           Bifidobacterium

 						   9      Lactobacillus

                                                                               
      Escherichia coli

    
      Clostridium 
                                                       7

                                          Enterococcus 

    
                                                   Veillonella

                                5
           Staphylococcus

                                                                                     
 		      Proteus              3

                          
                                                Ps. aeruginosa

                                                                      log jtk/g; log CFU/g  

Rys. 1. Układ mikroflory jelitowej (modyfikowane wg 17)

Czynniki środowiskowe

Człowiek

Odporność człowieka
Nabłonek jelitowy
Pankreatyna i inne soki trawienne
Enzymy
Kwasy żółciowe
Perystaltyka jelit
PH jelit
Potencjał redox

Wiek

Region zamieszkania
Klimat
Nawyki kulturowe

Płeć

Stres

 Choroby

Dieta
Antybiotyki i inne leki
Obce mikroorganizmy

Ekosystem jelitowy

Skład i metabolizm mikroflory jelitowej
Zależności ekologiczne (antagonizm, synergizm)

Rys. 2. Czynniki wpływające na układ mikroflory jelitowej człowieka (modyfikowane wg 11)

Streszczenie

Probiotyki są definiowane jako żywe mikroorganizmy, które po spożyciu wywierają korzystny wpływ na organizm człowieka poprzez poprawę równowagi mikroflory jelitowej. Większość szczepów o udokumentowanych właściwościach zdrowotnych należy do rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Cechy probiotyczne bakterii nie są jednak związane z rodzajem bakterii, ale z nielicznymi, specjalnie wyselekcjonowanymi szczepami danego gatunku. Kryteria ich selekcji obejmują aspekty bezpieczeństwa, funkcjonalne i technologiczne. Bezpieczeństwo szczepu jest określone jego pochodzeniem, brakiem powiązania z kulturami chorobotwórczymi oraz profilem oporności na antybiotyki. Aspekty funkcjonalne dokumentują ich zdolność przeżycia w przewodzie pokarmowym, działanie immunomodulacyjne, korzystny efekt w mutagenezie kałowej. Szczepy probiotyczne muszą spełniać ponadto wymagania stawiane przez technologie ich produkcji oraz zdolność przeżycia i zachowania swoich uzdolnień podczas przechowywania i dystrybucji gotowego wyrobu.  W ciągu ostatnich dziesięciu lat przeprowadzono wiele badań dokumentujących korzystne efekty działania probiotyków na zdrowie człowieka. Podkreśla się ich znaczenie  w stymulacji systemu odpornościowego człowieka, utrzymywaniu i przywracaniu właściwego układu endogennej mikroflory jelitowej, obniżeniu aktywności enzymów fekalnych uczestniczących w przekształcaniu substancji prokancerogennych w kancerogenne, Udokumentowano w licznych badaniach naukowych, że szczepy probiotyczne przywracają naturalny, właściwie funkcjonującego układ mikroflory jelitowej, hamują rozwój wielu mikroorganizmów chorobotwórczych, zmniejszają częstość występowania biegunek podróżnych, łagodzą przebieg i skracają czas trwania niektórych biegunek bakteryjnych i wirusowych (np. wywołanych przez Clostridium difficile, Shigella, Salmonella, enterotoksyczne szczepy Escherichia coli czy rotawirusy), zapobiegają wystąpieniu lub łagodzą przebieg biegunek poantybiotykowych, zmniejszają nasilenie biegunek popromiennych, likwidują lub zmniejszają objawy nietolerancji laktozy, działają hipocholesterolemicznie, mogą działać leczniczo w encefalopatii wątrobowej, a także normalizują zaburzenia motoryki jelit u ludzi w podeszłym wieku. Interesujące są także badana dokumentujace antagonizm bakterii probiotycznych w stosunku do Helicobacter pylori, bakterii związanej z powstawaniem wrzodów żołądka i dwunastnicy. Probiotyczne bakterie fermentacji mlekowej są tradycyjnie powiązane z produktami mleczarskimi, które  są uważane za najlepsze ich nośniki. 
Artykuł omawia podstawy teorii probiozy, korzyści płynące ze stosowania bakterii probiotycznych oraz wykorzystanie tych bakterii w produkcji mlecznych napojów fermentowanych o właściwościach.

Summary

Probiotics are defined as the viable microorganisms that exhibit a beneficial effect on the health of the host by improving its intestinal microbial balance. Promising probiotic strains include the members of genera Lactobacillus and Bifidobacterium. Several aspects, including safety, functional and technological characteristics, have to be taken into consideration in the selection process of probiotic microorganisms. Safety aspects include specifications such as origin, non-pathogenicity and antibiotic resistance characteristics. Functional aspects include viability and persistence in the gastrointestinal tract, immunomodulation, antagonistic and antimutagenic properties. Probiotic strains must be able to be manufactured under industrial conditions and have to survive and retain their functionality during storage of the products.  During the past ten years, a large number of extensive scientific research has been carried out to demonstrate the beneficial effects of probiotic lactic acid bacteria in humans. The main reported beneficial effects including: enhanced immune system, balancing of colonic microbiota, reduction of fecal enzymes involved in cancer initiation, tratment of diarrhea associated with travel and antibiotic therapy, control of rotavirus and Clostridium difficile induced colitis and prevention of ulcers related to Helicobacter pylori. Probiotics are also implicated in the reduction of serum cholesterol, the antagonism against food-borne pathogens and tooth decay organisms as well as the amelioration of lactose malabsorption symptoms. 
Probiotic cultures have been associated historically with cultured milks and dairy products, from which there is substantial evidence for positive effects on human health and general well-being. Future challenges include the incorporation of probiotics in combination with suitable prebiotic substrates to enhance the efficacy of the preparation for clinical use. The paper will cover the rationale of the probiotic theory, several health targets for probiotic bacteria and some probiotic products, mainly dairy products. 

LUC DE VUYST
HAMUJĄCE DZIAŁANIE PROBIOTYCZNYCH BAKTERII KWASU MLEKOWEGO

Research Group of Industrial Microbiology,
Fermentation Technology and Downstream Processing,
Department of Applied Biological Sciences.
Vrije Univesiteit Brussel, Pleinlaan 2, B-1950 Brussels, Belgium
Tel: +32 2 629  32  45
Fax: +32 2 629  27  20
e-mail: ldvuyst@vub.ac.be

Wstęp

Bakterie kwasu mlekowego są tradycyjnie stosowane do produkcji żywności fermentowanej, takiej jak: sery, jogurty, fermentowane kiełbasy, ciasta na zakwasie, kapusta kiszona, piwo, wino. Wynika to z ich wpływu na właściwości sensoryczne żywności, w której są obecne oraz hamowania procesów zepsucia żywności. Mikroorganizmy te są odpowiedzialne za wstępne zakwaszanie surowców poprzez produkcję kwasu mlekowego (szczepy homo- i heterofermentatywne) i kwasu octowego (szczepy heteroferentatywne). Kwasy organiczne, zwłaszcza niezdysocjowane, posiadają aktywność antymikrobiologiczną. Na ich hamujące działanie wpływa także obecność innych kwasów organicznych (np. kwasu mrówkowego), etanolu, dwutlenku węgla, diacetylu, nadltenku wodoru, bakteriocyn i antybiotyków.
	Ostatnio dużo uwagi poświęca się prozdrowotnym właściwościom niektórych szczepów bakterii kwasu mlekowego (LAB), które są nazywane probiotykami. Probiotyki są spotykane na rynku w postaci preparatów żywych komórek lub jako żywność zawierająca w swym składzie żywe bakterie. Spożycie odpowiedniej ilości takiej żywności ma dobroczynny wpływ na zdrowie człowieka. Szczepy posiadające właściwości probiotyczne należą do rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Są dodawane do jogurtów i napojów mlecznych lub dostępne jako preparaty farmaceutyczne. 
Prebiotyki są dodatkami do żywności, których korzystne działanie na organizm ludzki jest związane ze stymulacją wzrostu i aktywności niektórych szczepów mikroflory rodzimej lub wprowadzonej z zewnątrz wraz ze spożytą żywnością. Do tego typu substancji zaliczamy, nietrawione oligosacharydy (NDOs) np. fruktooligosacharydy (FOS). Probiotyczne bakterie kwasu mlekowego przyczyniają się do równoważenia naturalnej mikroflory jelitowej, zapobiegania i leczenia biegunek oraz mogą chronić przed infekcjami jelit, stymulują układ odpornościowy, wykazują aktywność antymikrobiologiczną. Jednak potwierdzenie tych właściwości w badaniach naukowych dotyczy tylko niektórych z nich.
	Szczególnie ważna jest potencjalna zdolność probiotyków do wzmacniania obrony nabłonkowej, zwłaszcza żołądkowej i w jelicie cienkim, np. zapobieganie lub zwalczanie infekcji wywołanych przez Helicobacter pylori i Salmonella enterica spp typhimurium. W tym kontekście działanie zdrowotne LAB po wprowadzeniu do mikroflory jelitowej człowieka będzie związane z ujawnieniem się właściwości antybakteryjnej w stosunku do patogenów, zarówno w hodowlach komórkowych jak i w próbach klinicznych.

Interakcje pomiędzy mikroflorą rodzimą i bakteriami enteropatogennymi

Prawidłowa mikroflora w przewodzie pokarmowym odgrywa bardzo ważną rolę w hamowaniu zasiedlania jelita grubego przez patogeny. Dowiedziono, że bifidobakterie, główny rodzaj mikroflory jelitowej, Lactobacillus jak i Escherichia coli (jeden z pierwszych rodzajów kolonizujących jelito człowieka) wywierają działanie antymikrobiologiczne w stosunku do patogenów. Różne mechanizmy umożliwiają odgrywanie takiej roli, np.:
•	konkurencja o składniki odżywcze,
•	zapobieganie przyleganiu patogenów, szczególnie przez konkurowanie o te same receptory w śluzówce lub nabłonku,
•	produkcja substancji antymikrobiologicznych (inhibitory metabolizmu, bakteriocyny, substancje bakteriocynopodobne lub niebakteriocyny), które usuwają patogeny z przewodu pokarmowego,
•	Poprawienie odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciw patogenom.
Prezentacja będzie dotyczyła potencjału probiotycznych bakterii kwasu mlekowego do produkcji i wydzielania substancji antymikrobiologicznych. Związki te mogą po kolei ingerować w mechanizmy adhezji groźnych bakterii do nabłonka komórek jelita i w ten sposób zapobiegać inwazyjności.

Produkcja substancji antymikrobiologicznych

Wiadomo, że probiotyczne LAB, zwłaszcza szczepy takich gatunków jak L. acidophilus, L. johnsoni, L. casei, B. animalis, B. bifidus, itd. przyczyniają się do równowagi mikroflory jelitowej. Kolonizacja przez patogeny może być ograniczona np. dzięki produkcji kwasów organicznych, które w rezultacie obniżają miejscowo pH środowiska. Aktywność L. acidophilus i L. casei przeciw H. pylori najprawdopodobniej jest rezultatem zmian pH związanych z produkcją kwasu mlekowego i octowego przez te szczepy. Ponadto niezdysocjowany kwas octowy prawdopodobnie odgrywa główną role w aktywności przeciwinfekcyjnej bifidobakterii. 
W ostatniej dekadzie odkryto, że większość szczepów L. acidophilus produkuje bakteriocyny. Ta właściwość leży u podstaw ich znaczenia w ekosystemie przewodu pokarmowego. Do tej pory wyizolowano i oczyszczono kilka bakteriocyn produkowanych przez szczepy, które wcześniej wyizolowano z kału. Kilka z nich hamowało wzrost takich patogenów jak E. coli, Salmonella spp., Wśród szczepów stosowanych w przemyśle spożywczym nie znaleziono jednak takich, które produkowałyby bakteriocyny. Tym niemniej stwierdzono, że szczepy probiotyczne posiadają aktywność antymikrobiologiczną z racji produkcji peptydów o właściwościach inhibicyjnych. Tylko jeden jogurt na rynku zawierał szczep L. acidophilus LA-1, który produkuje bakteriocynę (tzw. acidofilina LA-1 o masie     50 kDa). Duża masa molekularna wynikała z nie oczyszczonego homogenizatu, nie określono też aminokwasów i genów odpowiedzialnych za produkcję tej substancji. Bakteriocyny produkowane przez LAB są zwykle aktywne przeciw bakteriom G+. Bakterie G- mogą stać się także wrażliwe na bakteriocyny tylko wtedy, kiedy struktura ściany komórkowej jest zniszczona. Bardzo wąskie spektrum hamowania wzrostu wydaje się być powszechnym zjawiskiem wśród grupy szczepów L. acidophilus produkujących bakteriocyny. Pozostaje pytanie, czy bakteriocyny odgrywają rolę w przewodzie pokarmowym. Wiele szczepów Lactobacillus produkuje substancje antybakteryjne, kwasowe, o niskiej masie molekularnej, których aktywność przeciwbakteryjna obejmuje bakterie G + i G -. Zważywszy na tę charakterystykę, części składowe aktywności antybakteryjnej wskazują na różnice między bakteriocynami i mikrocynami. Bakteriocyny produkowane przez Lactobacillus są z definicji substancjami białkopodobnymi, przeciwbakteryjnymi, które wykazują aktywność przeciw bakteriom blisko z nimi powiązanymi, natomiast małą lub żadnego działania hamującego przeciw innym grupom bakterii. Mikrocyny wytwarzane przez kilka gatunków z rodziny Enterobacteriaceae, przeważnie szczepy E. coli są peptydowymi antybiotykami o niskiej masie molekularnej, niewrażliwymi na proteazy, aktywnymi tylko przeciw bakteriom G-. Wspomniane wyżej związki wymagają oczyszczenia i dalszej charakterystyki chemicznej.
Właściwości substancji antymikrobiologicznych są często mało znane, szczególnie w przypadku probiotyków stosowanych przemysłowo. Przykładowo, szeroko stosowany szczep L. johnsoni LA-1 hamuje adhezję i inwazję przez enterowirulentne bakterie w warunkach in vivo i in vitro, zarówno G + (np. Listeria monocytogenes) i G - (np. Salmonella typhimurium). Produkuje on złożone substancje antybakteryjne, które są stosunkowo niewrażliwe na proteazy i niezależne od produkcji kwasu mlekowego. Nie obserwuje się tej aktywności odnośnie naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego, tj. bifidobakterii i laktobacillusów. Jednakże pozostałe właściwości substancji wydzielanych przez ten szczep wymagają dokładniejszego określenia. Twierdzi się jednak, że nie są to bakteriocyny. Ostatnio stwierdzono, że supernatant L. johnsoni LA-1 hamował wzrost H. pylori zmniejszając ich liczbę in vivo u zdrowych wolontariuszy. Działanie to mogło wynikać tylko częściowo z obecności produkowanego przez bakterie kwasu mlekowego. Substancje hamujące wzrost były ciepłodporne, niezależne od stężenia mocznika, czy obecności komórek LA-1 w medium, ale rozpadały się, kiedy pH supernatantu wzrastało do 6,0. Jest jednak prawdopodobne, że całościowe hamowanie rozwoju patogenów w przewodzie pokarmowym jest zależne od synergicznego działania kwasów organicznych, substancji białkowych lub innych czynników hamujących.
	Dobrze znana jest selektywna stymulacja wzrostu Bifidibacterium spp przez NDOs i FOS, zarówno in vitro jak i in vivo. W dodatku często powstrzymywany jest wzrost bakterii patogennych tj. E. coli, Salmonella sp i Clostridium perfringens. Zarówno związki o aktywności antybakteryjnej (kwasy organiczne i bakteriocyny lub substancje bakteriocynopodone) jak i specyficzna aktywność enzymatyczna (np. fruktozydaza i galaktozydaza) umożliwi selektywny wzrost probiotyków. Ostatnio zcharakteryzowano bakteriocynę produkowaną przez B. bifidum, ale była ona aktywna tylko w stosunku bakterii G+. Stwierdzono zatrzymanie adherencji przez enterotoksyczne szczepy E. coli przez czynniki białkopodobne o wysokiej masie molekularnej, a także przez niezidentyfikowane, lipofilne molekuły z dwóch szczepów Bifidobacterium z naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego niemowląt. To ostatnie działanie dotyczyło bakterii takich jak S. typhimurium i G-. Podsumowując podawanie synbiotyków może prowadzić do wzrostu odporności na takie patogeny jak Salmonella enterica spp typhimurium.

Wnioski

Nie jest jeszcze poznana do końca charakterystyka molekularna substancji pochodzących z probiotycznych bakterii kwasu mlekowego, które są odpowiedzialne za hamowanie wzrostu patogennych bakterii w przewodzie pokarmowym. Ponadto nadal istnieje potrzeba wyjaśnienia czy bakteriocyny są produkowane przez probiotyki, a jeśli jest tak naprawdę, czy te związki mogą być odpowiedzialne za inaktywacje bakterii patogennych (G-) w przewodzie pokarmowym. Działanie bakteriocynopodobne i antybiotykopodobne, przeciw enterowirulentnym bakteriom wspomaga terapeutyczne działanie wyselekcjonowanych od ludzi szczepów Lactobacillus. Wyzwaniem dla przemysł spożywczego i farmaceutycznego będzie przeprowadzenie w wielu ośrodkach, wielodyscyplinarnego, dobrze zaplanowanego badania klincznego ze ślepą próbą. Badanie to będzie miało na celu ustalenie zdrowotnych korzyści lub terapeutycznej skuteczności wybranych szczepów Lactobacillus i Bifidobacterium, stosowanych w żywności funkcjonalnej jako bioterapeutyczne dodatki. Unijny projekt PROPATH (należący do PROEUHEALTH, czy grupy The Food, GI-tract Functionlity and Human Health), przyczynia się do rozpowszechniania wiedzy o mechanizmach hamowania wzrostu bakterii G-, bakterii patogennych przez probiotyki (Bifidobacterium i Lactobacillus spp). Testuje się dwa patogeny Salmonella enterica spp typhimurium i  Helicobacter pylori. W szczególności będzie badany wzrost bifidobakterii z dodatkiem prebiotyków. Projekt będzie się dalej zajmował badaniami klinicznymi związanymi z biegunką u dzieci, zespołem nadwrażliwości jelita grubego, chorobą wrzodową i zapobieganiem tym chorobom dzięki stosowaniu pro- i prebiotyków.

LUC DE VUYST
INHIBITORY EFFECTS OF PROBIOTIC LACTIC ACID BACTERIA

Research Group of Industrial Microbiology, Fermentation Technology and Downstream Processing, Department of Applied Biological Sciences, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, B-1050 Brussels, Belgium. Tel: +32-2-629 32 45. Fax: +32-2-629 27 20. E-mail: ldvuyst@vub.ac.be.

Introduction

Lactic acid bacteria are traditionally applied in the production of fermented foods and beverages such as cheese, yogurt, fermented sausage, sourdough, sauerkraut, beer, and wine, because of their contribution to the sensory qualities of the food and the prevention of food spoilage. These microbes are in particular responsible for the initial acidification of the raw materials through the production of lactic acid (homo- and heterofermentative strains) and acetic acid (only heterofermentative strains). The organic acids, in particular the undissociated molecules, display antimicrobial activies. Also other inhibitory compounds contribute to their antimicrobial potential such as other organic acids (e.g. formic acid), ethanol, carbon dioxide, diacetyl, hydrogen peroxide, bacteriocins, and antibiotics. 
Recently, a lot of attention is paid to the health-promoting properties of certain lactic acid bacterium strains, some of which have been promoted as probiotics. Probiotics are viable cell preparations or foods containing living bacteria that after consumption of a certain number have beneficial effects on the health of the host. Examples are lactobacilli and bifidobacteria that are applied in yoghurts and fermented milks, or that are supplied as pharmaceutical preparations. Prebiotics are non-digestible food ingredients that affect the host beneficially by selectively stimulating the growth and metabolic activity of a limited number of naturally present or orally introduced bacteria in the colon, particularly bifidobacteria, and thereby improve host health. Examples are non-digestible oligosaccharides (NDOs) such as fructo-oligosaccharides (FOS). Probiotic lactic acid bacteria contribute to the balancing of a normal, healthy, intestinal microflora, and to the prevention and curing of diarrhoea, and may protect against gastrointestinal infections by pathogenic strains, stimulate the immunity system, display anti-carcinogenic activities, etc. However, only a very limited number of these ‘health claims’ has been approved scientifically. 
Of particular importance is the potential of probiotics to reinforce mucosal defence, especially at the gastric and small bowel levels, for instance to prevent or combat infections with Helicobacter pylori and Salmonella enterica serovar Typhimurium, respectively. In this context, health-beneficial lactic acid bacterium strains able to be incorporated into the human intestinal microflora, have been shown to display anti-pathogenic effects towards these gastrointestinal pathogens either in cellular or animal models or in clinical trials. 

Interaction of the resident microflora and enteropathogenic bacteria

The resident microflora of the gastrointestinal tract plays an important role in inhibiting gut colonisation by incoming pathogens. It has indeed been reported that bifidobacteria, a major species of the colonic microflora, and lactobacilli, a minor species of the gut microflora, as well as Escherichia coli, one of the first bacterial genera that colonise the intestines of humans, exert antimicrobial activity towards pathogens. Different mechanisms enable the gut microflora to play such a role:

(i)	the competition for substrates;
(ii)	the prevention of pathogen adherence by specifically competing for the same receptor sites on the epithelium or mucus, or alternatively by providing an aspecific steric hindrance as a barrier to mucosal colonisation;
(iii)	the production of antimicrobial substances (inhibitory metabolites, bacteriocins, bacteriocin-like, or non-bacteriocin substances) to remove pathogens from the intestine;
(iv)	an enhancement of the host immune response against pathogens.

This paper will deal with the potential of probiotic lactic acid bacteria to produce secreted antimicrobial substances. Antimicrobials could in turn interfere with the adhesion mechanisms of enterovirulent bacteria to the epithelial cell surface, thereby preventing the severity of invasiveness and hence infection.

Production of antimicrobial substances

It is well known that probiotic lactic acid bacteria, in particular strains of the species L. acidophilus, L. johnsonii, L. casei, B. animalis, B. bifidum, etc. contribute to the stabilisation of the gut microflora. They may avoid the colonisation of pathogenic bacteria, for instance through the production of organic acids, resulting in a decrease of the local pH. Anti-H. pylori activity of L. acidophilus and L. casei most probably results from such a pH alteration and lactic and acetic acids produced by these strains. Moreover, undissociated acetic acid most probably plays a pivotal role in the anti-infectious activity of bifidobacteria. 
In the last decade, it has been found that a majority of the L. acidophilus strains produce bacteriocins, underlying their potential importance in the complex gastrointestinal ecosystem. Up to now several bacteriocins from strains isolated from faeces have been isolated and purified. Some of them have been shown to inhibit gastrointestinal pathogens such as E. coli and Salmonella spp. However, no bacteriocins were shown among commercially available probiotic strains. Nevertheless, it has been claimed that probiotic strains possess antagonistic activities due to the production of inhibitory peptides. Only one 50-kDa bacteriocin, referred to as acidophilicin LA-1, produced by a L. acidophilus LA-1 strain isolated from a commercial multiple-strain yoghurt starter culture, has been reported recently. This high-molecular-mass protein was not purified to homogeneity, neither was the amino acid or gene sequence determined. In addition, bacteriocins produced by lactic acid bacteria are in general only active towards Gram-positive bacteria. Only when the structure of their cell surface is disturbed, also Gram-negative bacteria can become sensitive. Moreover, a very narrow inhibitory spectrum seems to be common among bacteriocin-producing isolates from the L. acidophilus group. The question remains whether bacteriocins play a role in the gastrointestinal tract. On the other hand, several Lactobacillus strains produce antibacterial, acidic, low-molecular-mass, heat-stable, non-proteinaceous compounds with an inhibitory spectrum including both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Considering these characteristics, the components supporting the antimicrobial activity appear different from bacteriocins and microcins. Indeed, the bacteriocins produced by lactobacilli are by definition proteinaceous antibacterial compounds that exhibit an effect against closely related bacteria and show little or no inhibition against other bacteria. The microcins, produced by some members of the Enterobacteriaceae, mostly E. coli strains, are peptide antibiotics with low molecular mass, insensitive to proteases, and active against Gram-negative bacteria only. Hence, the components mentioned above remain to be purified and chemically characterised. 
The fact that the nature of the antibacterial substances is often unknown is particularly the case for commercial probiotic lactic acid bacterium strains. For instance, the widespread probiotic L. johnsonii La1 strain inhibits cell adhesion and cell invasion by enterovirulent bacteria both in vitro and in vivo, including both Gram-positive (e.g. Listeria monocytogenes) and Gram-negative (e.g. Salmonella typhimurium) bacteria. It produces an antibacterial compound that is relatively insensitive towards proteases and independent of lactic acid production. No activity has been observed towards the normal intestinal flora such as lactobacilli and bifidobacteria. However, the nature of the antimicrobial component(s) secreted by L. johnsonii La1 remains to be determined. It has been claimed that it is not a bacteriocin. Recently, it has been demonstrated that supernatant of L. johnsonii La1 inhibits the growth of H. pylori in vitro, and decreases H. pylori density in healthy volunteers. The effect could be only partly due to lactic acid. This inhibitory activity was heat resistant, dialyzable, and independent of the presence of urea or La1 cells in the medium but was lost when the pH of the supernatant was raised to 6.0. It is, however, probable that overall inhibition of gastrointestinal pathogens may be due to a synergistic action of organic acids, proteinaceous substances, or other inhibitory agents.
Finally, it is well known that NDOs such as FOS selectively stimulate the growth of Bifidobacterium spp., both in vitro and in vivo. In addition, the growth of pathogenic bacteria like Escherichia coli, Salmonella sp. and Clostridium perfringens is often suppressed. Both antimicrobial compounds (organic acids and bacteriocins or bacteriocin-like agents) (inhibiting effect) and specific enzyme activities (for instance fructosidase and galactosidase) enabling their selective growth on prebiotic substrates (stimulating effect) may be responsible for the bifidogenic effect. Recently, a bacteriocin (bifidocin B) from Bifidobacterium bifidum has been characterised, but it was only active towards Gram-positive bacteria. A high-molecular-mass proteinaceous factor was found to inhibit adherence of an enterotoxigenic E. coli strain, and an unidentified lipophilic molecule from two Bifidobacterium strains from resident infant gastrointestinal microflora was found to be antibacterial too, including Gram-negative pathogens like S. typhimurium. Finally, synbiotic administration of bifidobacteria and NDOs may result in an increased resistance to pathogens like S. enterica serovar Typhimurium. 

Conclusion

The molecular identity of the compounds derived from probiotic lactic acid bacterium strains which are responsible for the inhibition of gastrointestinal pathogenic bacteria, has not been elucidated. In addition, it still has to be confirmed whether bacteriocins are produced by probiotic lactic acid bacteria, and, if this is the case, whether these compounds may be responsible for the inactivation of (Gram-negative) pathogenic bacteria in the gastrointestinal tract. Bacteriocin-like and antibiotic-like activities support the therapeutic effect of the selected human lactobacilli strains against enterovirulent bacteria. However, the challenge for the food and pharmaceutical industries will be to conduct well-designed, placebo-controlled, multidisciplinary and multicenter clinical investigations to ascertain the health benefits or therapeutic efficacy of selected lactobacilli and bifidobacteria strains to be used as functional foods or biotherapeutic agents. The EC project PROPATH (belonging to the PROEUHEALTH or The Food, GI-tract Functionality and Human Health cluster) contributes to the elucidation of the mechanism of the inhibition of Gram-negative, pathogenic bacteria by probiotic lactic acid bacterium strains (Lactobacillus spp. and bifidobacteria). The two test cases are Salmonella enterica serovar Typhimurium and Helicobacter pylori. Bifidobacteria will be considered in particular when growing on NDOs as prebiotic substrate. The project will further deal with clinical studies related to infants’ diarrhoea, irritable bowel syndrome, and peptic ulcer disease, to treat or protect against these diseases with approved pro- and prebiotics. 

JAN VAN LOO
MOŻLIWOŚCI PROBIOTYKÓW I PREBIOTYKÓW (SYNBIOTYKÓW) W CELU OBNIŻENIA RYZYKA NOWOTWORÓW.

ORAFTI, Tienen, Belgia

Rak

	Rak to popularny, ogólny termin dla określenia nowotworów złośliwych, szeroko opisywanej grupy chorób o nieznanych i prawdopodobnie licznych przyczynach.
Na występowanie raka wpływa wiele czynników. Najważniejszym z nich jest dieta (powoduje 35% wszystkich zgonów z powodu raka), następne czynniki związane są ze stylem życia (tytoń 30%, zachowania rozrodcze 7%, i alkohol 3%). Czynnik środowiskowe powodują ok. 20% zgonów (infekcje 9%, praca 4%, zanieczyszczenie, produkty przemysłowe, leki, czynniki geofizyczne), a czynniki dziedziczne są przyczyną ok. 5% zgonów. Występowanie raka u mężczyzn jest dwa razy częstsze niż u kobiet. Mężczyźni najczęściej zapadają na raka płuc, a następnie raka jelit i prostaty. Kobiety – na raka piersi, jelit i płuc. Z danych powyższych wynika, że ponad 75% przypadków nowotworów może wynikać z diety lub stylu życia. Jednakże zmiana zwyczajów żywieniowych u znacznej części populacji to długi proces, wymagający znacznych wysiłków propagandowych, zarówno ze strony rządowej, jak i producentów.

Inulina i oligofruktoza jako przykłady prebiotyków

	Prebiotyki, jak np. inulina i oligofruktoza, są naturalnymi składnikami powszechnie dostępnej żywności pochodzenia roślinnego, np. cykorii, cebuli, czosnku, pomidorów, bananów, pszenicy itp. Średnie spożycie prebiotyków w zwykłej diecie wynosi około kilku gramów dziennie (Van Loo i in., 1995).
Inulina jest przemysłowo otrzymywana z korzeni cykorii przez ekstrakcję gorącą wodą, rafinację i suszenie rozpyłowe. Jest to zdyspergowana mieszanina liniowych molekuł, wszystkich o takiej samej podstawowej strukturze chemicznej, oznaczanej jako G-Fn (gdzie: G to reszta glukozowa, F – reszta fruktozowa i n – liczba cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem (2-1)). Stopień polimeryzacji (DP) natywnej inuliny z cykorii waha się pomiędzy 3 a 65, z wartością średnią (DPav) wynoszącą 10. Inulina, której cześć o niższym DP została usunięta (w wyniku czego DPav wynosi ok. 25), zwana jest inuliną o wysokiej wydajności (HP-inuliną lub inuliną High Performance). Olgofruktoza jest otrzymana przez częściową hydrolizę enzymatyczną inuliny. Składa się z prostych łańcuchów G-Fn i F-Fn o DP wahającym się w granicach 2-8 (z DPav około 4). Synergy 1 to inulina o specyficznym rozłożeniu długości łańcucha.
	Wiązanie (2-1), łączy wszystkie reszty fruktozy w łańcuchu węglowodanowym, nie może być hydrolizowane w jelicie kręgowców, także u ludzi. W związku z tym inulina i oligofruktoza i HP-inulina nie są trawione w górnej części jelita i praktycznie w całości (>90%) docierają do okrężnicy (Ellegard i in., 1997). W tym momencie te nie strawione oligosacharydy ulegają całkowitej fermentacji. W wyniku tego procesu selektywnie wspomagają rozwój pewnych grup bakterii. Wśród nich są bifidobakterie i bakterie kwasu mlekowego (LAB), powszechnie uważane za wskaźniki dobrze zrównowżonej mikroflory jelitowej. Ta zmodyfikowana flora jelitowa i metabolity, które produkuje wchodzą w interakcje z organizmem ludzkim. Te interakcje zachodzą przez powierzchnię przewodu pokarmowego, z której tylko okrężnica ma wielkość kortu tenisowego. Wiązanie glukozydowe (2-1) łącząc reszty heksozy jest odpowiedzialne za niestrawność w górnym odcinku przewodu pokarmowego, także w przypadku innych typów węglowodanów prebiotycznych. Selektywność fermentacji, drugi warunek konieczny do nazywania oligosacharydów prebiotykami, jest różna w tych substratach w związku z różnymi typami wiązań pomiędzy innymi rodzajami monosacharydów (Van Loo, 1999).

Właściwości odżywcze

	Liczne badania nad prawidłowym żywieniem człowieka wskazują, że spożycie prebiotyków definitywnie zmienia mikroflorę jelitową i jej aktywność metaboliczną (Roberfroid i in., Kurse, 2000). Prawdopodobnie jako wynik zmienionego ekosystemu okrężnicy występuje modulacja metabolizmu lipidowego (Davidson i in., Jackson i in., Brighenti i in., 1999), zwiększona przyswajalność wapnia (Van de Heuvel i in., Coudray i in., Abrams i in., 2002), modyfikacja systemu odpornościowego u małych dzieci (Tschernia i in., Saavedra i in., 2000) i modyfikacja funkcji jelit.
Ostatnio przeprowadzone zostały różnorodne badania z wykorzystaniem eksperymentalnych modeli przeciwnowotworowych. Następny rozdział przedstawia różne modele zwierzęce stosowane w badaniach raka i wyniki otrzymane przy użyciu pre- i probiotyków.

Właściwości przeciwnowotworowe prebiotyków

Modele chemoprewencji

W tych modelach zwierzęta są prowokowane przez substancje rakotwórcze, które indukują proces karcenogenezy w wybranych organach.
Iniekcje zawierające azometan (AMO) lub dimetylohydrazynę (DMH) stosowane są do wywoływania raka okrężnicy, podczas gdy 4-metylonitrozomocznik (MNU) używany jest w celu spowodowania raka piersi u żeńskich osobników zwierząt laboratoryjnych. Zwierzętom podawana jest dieta kontrolna lub dieta zawierająca inulinę albo oligofruktozę (dodatek 5-10%). Miernikiem rakotwórczości wśród tych zwierząt jest rozwój przednowotworowych zmian chorobowych po 2 miesiącach lub dłuższym czasie (33 tyg. do 1 roku). Z danych wynika, że w przypadku stosowania prebiotyków otrzymuje się znaczne zmniejszenie wskaźników karcenogenezy. Efekty chemoprewencyjne zależne są od dawki i stają się bardziej wyraźne wraz ze zwiększeniem długości łańcucha fruktanów prebiotyków typu inulinowego (z DPav - 4 na DPav - 25). Efekt ten jest już widoczny, gdy prebiotyki są podawane jedynie przed wstrzyknięciem karcenogenu, czyli w fazie iniekcji. Efekty działania prebiotyków w fazie promocji, testowane przez podawanie prebiotyków po wstrzyknięciu karcenogenu, okazały się jeszcze wyraźniejsze. Redukcja biomarkerów karcenogenezy jest proporcjonalna w całej okrężnicy. Większość danych została uzyskana w badaniach nad młodymi szczurami, ale rezultaty zostały potwierdzone także u dorosłych szczurów, które stanowią lepszy model populacji ludzkich.
Rozwój chemicznie wywołanego raka piersi został także znacząco zmniejszony przez karmienie zwierząt pożywieniem zawierającym prebiotyki. Oznacza to, że działanie przeciwrakowe nie jest zjawiskiem lokalnym, ale że należy rozpatrywać interakcje w całym organizmie.

Modele wszczepiania komórek nowotworowych

Ten typ eksperymentu polega na wszczepianiu agresywnych i inwazyjnych komórek nowotworowych do mięśni lub otrzewnej myszy. Zwierzęta są karmione odpowiednią dietą (kontrolną, z prebiotykiem, z probiotykiem) 1-2 tygodnie przed wszczepieniem komórek rakowych. Krzywa śmiertelności, wyraża jak wzrasta rozpiętość życia lub średni czas przeżycia. Ocena preparatów histologicznych pozwala zwrócić uwagę na aspekt przerzutowy oraz rozmiar i typ guzów.
Dane wskazują konsekwentnie, że prebiotyki powodują obniżenie krzywej śmiertelności i redukcję wzrostu przeszczepionych, wątrobowych komórek rakowych. To wyraźnie dowodzi, że brane są pod uwagę czynniki całościowe, dla całego organizmu.
W innej wersji tego modelu, badano komórki guza z powstałych przerzutów. Zbadano mikroskopowo liczbę i morfologię przerzutów w płucach. Okazało się, że u zwierząt karmionych prebiotykami zmiany nowotworowe są tam mniejsze, jeżeli chodzi ilość i rozmiar komórek rakowych w porównaniu do próby kontrolnej (Taper i in., 1997, 1998, 1999, 2000).

Modele predeterminowane genetycznie

	U myszy Apc Min guzy rozwijają się spontanicznie, głównie w jelicie cienkim, ale tylko kilka w okrężnicy. Doświadczenia z tymi modelami pokazują, że spożywanie prebiotyków prawie nie redukuje przypadków guzów w jelicie cienkim, ale zmniejsza ich liczbę w okrężnicy. (Pierre i in., 1997).
Te wyniki dotyczą także przypadków ludzkich, to jest jasne nawet, jeśli dietą wyjaśnia ponad 75% przypadków raka, jednak wrodzone właściwości genetyczne mogą odgrywać ważną role, w przypadku rozwoju procesu karcenogenezy.

Synbiotyki

	W przypadku probiotyków istnieje mniej dowodów bezpośredniego hamowania karcenogenezy w modelach doświadczalnych. Synbiotyki są kombinacją probiotyków i prebiotyków. Podstawowe badania przeciwnowotworowe (badania chemoprewencji Rowland’a i in., 1998) wskazują, że kiedy prebiotyk - inulina jest połączona z probiotykiem (Bifidobacterium longum) inhibicja przypadków raka była synergicznie redukowana.
Początkową hipotezą było, że prebiotyki są wyselekcjonowaną żywnością, dla probiotyków, które jako takie mogły wywierać ten dobroczynny efekt bardziej gruntownie.
Później wyłoniła się idea, że prawdopodobnie bezpośrednia interakcja pomiędzy prebiotykiem i probiorykiem nie jest konieczna. Obserwowany synergizm mógł być skutkiem dwóch odrębnych procesów inhibicyjnych karcenogenezy, każdy na swój własny sposób. Kiedy proces rakotwórczy jest rezultatem kompleksu procesów, ogólna inhibicja jest wynikiem poszczególnych inhibicji kolejnych etapów.

Walidacja danych eksperymentalnych w badaniach interwencji żywieniowej

Powtarzanie i publikowanie spójnych danych pochodzących z różnych modeli eksperymentalnych, wskazujących, że prebiotyki mają działanie przeciwnowotworowe będzie trafne tylko wtedy, kiedy zostaną potwierdzone w badaniach dietetycznych.
W momencie rozpoczęcia finansowania badań przez Unię Europejską należało przewidzieć, że jeśli istnieją wskazówki, iż łączenie probiotyków i prebiotyków w synbiotyki może mieć działanie przeciwnowotworowe, należy przeprowadzić badania z synbiotykami i takie właśnie badania zostały przyjęte do finansowania przez EU DG Research.
Jeśli nie znano mechanizmów i jeśli rozdział badań nie był przekonujący, odwoływano się do wcześniejszych badań. Projekt SYNCAN był opracowany jako projekt Biomarker. Wybrano trzy grupy biomarkerów po to, aby objąć wszystkie możliwe, wczesne wskaźniki karcenogenezy. Pod względem produkcji cytotoksycznych i genotoksycznych składowych w okrężnicy i odbytnicy monitoruje się biomarkery immunologiczne, mierzone we krwi, biomarkery genetyczne i śluzówkowe oznaczane za pomocą biopsji.
Badania nad interwencją żywieniową są sercem projektu SYNCAN. Jest on wspierany przez badania in vitro interakcji pre/probiotyków i przez doświadczenia na szczurach, tak aby zyskać lesze zrozumienie mechanizmów. Zapoczątkowane próby z tych doświadczeń są wysyłane do sieci BIOMARKER i poddawane analizie. Praca z biomarkerami wymaga dalszej optymalizacji metodologii i wykonywania analizy próbek.

JAN VAN LOO
PREBIOTICS + PROBIOTICS (SYNBIOTICS) OPEN PERSPECTIVES TO REDUCE THE RISK FOR CANCER BY DIETARY MEANS.

ORAFTI, Tienen, Belgium

Cancer

Cancer is a popular generic term for malignant neoplasm, an elaborate group of diseases of unknown and probably multiple causes. 
Several factors affect cancer incidence. The most important one is diet (causing 35% of all cancer deaths), followed by lifestyle factors (tobacco 30%; reproductive behaviour 7% and alcohol 3%). The environment would cause some 20% of all cancer deaths (infections 9%, occupation 4%, pollution, industrial products, medicines, geophysical) and hereditary factors account for about 5% of cancer deaths. The incidence in men is twice as high in men as in women. In men lung cancer is most important followed by intestine and prostate. IN women, breast cancer is most important, followed by intestine and lung. From these statistics, it appears that over 75% of cancers can be influenced by either lifestyle or diet. However, changing dietary habits in a significant part of the population is a lengthy process and requires important efforts from both government and industry to distribute information. 

Inulin and Oligofructose as a model for prebiotics

Prebiotics, such as chicory inulin and oligofructose, are natural constituents of many common foodplants including onion, garlic, tomato, banana, wheat etc. The average consumption of prebiotics in the normal human diet has been evaluated at several grams per day (Van Loo et al., 1995).
Inulin is industrially obtained from chicory roots by hot water extraction, followed by refining and spray drying. It is a polydisperse mixture of linear molecules, all with the same basic chemical structure which is symbolised as G-Fn (with G: glucosyl moiety, F: fructosyl moiety and n: number of fructose units linked together through ß(2-1) bonds. The degree of polymerisation (DP) of native chicory inulin ranges between 3 and 65, with an average (DPav) of 10. Inulin, from which the lower DP-fraction has been physically removed, resulting in a DPav of about 25, is called HP-inulin or High Performance inulin. A short chain fraction, called oligofructose is obtained by partial enzymatic hydrolysis of inulin. It is composed of linear G-Fn and F-Fn chains with a DP ranging from 2 to 8 (DPav is about 4). Synergy1 is inulin with a specific distribution of chain lengths.

The ß(2-1) bond, linking up all fructose moieties in the carbohydrate chain cannot be hydrolysed in the intestine of vertebrates in general and of humans in particular. As such, inulin, oligofructose and HP-inulin escape digestion in the upper intestinal tract and arrive almost quantitatively (>90%) in the colon (Ellegard et al., 1997). At that point, these non digestible oligosaccharides are completely fermented. During fermentation, they selectively promote the growth of certain groups of bacteria. Amongst these are the bifidobacteria and the lactic acid bacteria, organisms considered indicators of a well-balanced intestinal flora. This modified intestinal flora and the metabolites that it produces interact with the human body. This interaction occurs through the surface of the intestinal tract, of which the colon alone has the surface of a tennis court.
The ß (2-1) glucosidic bond linking up hexose moieties is also in other types of prebiotic carbohydrates responsible for their non digestibility in the upper GI tract. The selectivity of fermentation, which is the second condition for an oligosaccharide to be called a prebiotic, differs amongst these substrates due to other types of links between other types of monoses (Van Loo, 1999).

Nutritional properties

Several human dietary intervention studies have shown that consumption of prebiotics dramatically modifies the intestinal flora and its metabolic acitivity (Roberfroid et al., 1998; Kruse, 2000). Probably as a consequence of this modified colonic ecosystem, there is modulation of lipid metabolism (Davidson et al., Jackson et al ; Brighenti et al., 1999), increased calcium absorption (Van den Heuvel et al; Coudray et al; Abrams et al. 2002 ), modulation of the immune system in young children (Tschernia et al 2000; Saavedra et al 2000) and modulation of gut function (Den Hond 2000). 
Recently, an impressive variety of studies in experimental anticancer models has been performed. The next section describes the different animal models in cancer research and the results obtained with pre- and probiotics.

Anticancer properties of the prebiotics

Chemoprevention models

In these models, the animals are challenged by a carcinogenic substance that induces processes of carcinogenesis in specific organs. 
Injection with azoxymethane (AOM) or dimethylhydrazine (DMH) is used to induce colon cancers, while 4-methyl nitrosoureum (MNU) is used to induce breast cancer in female test animals. 
The animals receive either a control diet or a diet containing the inulin or oligofructose  (5 to 10% added to the diet). In these animals, the development of either preneoplastic lesions after 2months or tumours after a longer period of time (33w to 1yr) are counted as a measure of carcinogenicity.
From these data it was concluded that there is a consequent significant reduction in markers for carcinogenesis. The chemopreventive effects are dose-dependent and become more pronounced with increasing chain length (DPav 4 to DPav 25) of the prebiotic inulin-type fructans. The effect is already observed when prebiotics are only fed before injection of the carcinogens, i.e. during the initiation phase. The effect of prebiotics on the promotion phase, tested by feeding the prebiotic after carcinogen injection, is even more pronounced. The reduction in biomarkers for carcinogenesis is proportional in all parts of the colon. Most of the data were generated with young rats, but they were confirmed in adult rats as well, which would be a better match for what happens in human populations.

The development of chemically induced breast cancer was also significantly suppressed by feeding the animals prebiotic containing food. This indicates that the cancer preventing action is not a local phenomenon, but that systemic effects are involved (Reddy et al 1997, Rowland et al 1998, Verghese et al. 2002 A and B).

Tumour implantation models

In this type of experiments, aggressive and invasive tumour cells are implanted either in the muscle or in the peritoneum of mice. The animals are fed either control, prebiotic or probiotic supplemented food one to two weeks before tumour implantation. Mortality curves, expressed as increase in life span or mean survival time, are monitored. Microscopic histological evaluation allows to draw conclusions on metastatic aspects or size and type of tumour.
These data show consistently that prebiotics retard the mortality curves and reduce the growth of transplanted liver tumour cells. This clearly indicates that systemic factors are involved.
In another version of this model, the tumour cells were allowed to metastasise (i.p. application). The number and the morphology of the lung metastases were microscopically investigated. It appeared that there are less metastases and that the size of the metastases is smaller in animals fed the prebiotic, compared to the control animals (Taper et al. 1997, 1998, 1999, 2000).

Genetically predetermined models

Apc Min mice spontaneously develop tumours, mainly in the small intestine but also a few in the colon. Experiments with this model have shown that consumption of prebiotics hardly reduce the incidence of tumours in the small intestine, but reduced the number tumours in the colon (Pierre et al. 1997). 
These results also are relevant for the human situation, as it is clear that even if diet explains over 75% of cancer incidence, inherent genetic properties of the individuals may also play an important role in the ease with which processes of carcinogenesis can proceed.

Synbiotics

For probiotics there is less evidence of direct inhibitory effects of carcinogenesis in experimental models. 
Synbiotics are a combination of probiotics and prebiotics. Preliminary anticancer research (chemoprevention study by Rowland et al 1998) has revealed that when prebiotic inulin is combined with a probiotic (Bifidobacterium longum) the inhibition of ACF incidence was synergistically reduced. 
The hypothesis at first was that the prebiotic was a selective food for the probiotic, which as such could exert it's beneficial effects more thoroughly. 
Later on the idea has grown that probably such a direct interaction between the prebiotic and the probiotic is not really necessary. The synergy which was observed could come from both inhibiting different processes of carcinogenesis on their own way. As carcinogenesis is a result of a complex sequence of processes, overall inhibition is the product of the fractional inhibition of individual steps.

Validation of the experimental data in human dietary intervention studies

The repeated and reproduced and consistent experimental data originating from various experimental models which indicate that prebiotics are anticarcinogenic only are of any relevance if they can be confirmed or validated in human dietary intervention studies. 

As EU sponsored research needs to be pre-competitive, and as there were indications that combining prebiotics and probiotics in a synbiotic would have more anticarcinogenic impact, a research proposal with synbiotics was submitted to and accepted for sponsoring by the EU DG Research.

As no mechanisms are known and as at this stage of research it is not wise to organise years-lasting recurrence (of polyps or of tumours) experiments, the SYNCAN project was conceived as a Biomarker project. Three groups of biomarkers were thought to cover all possible early indications of carcinogenesis. These involve immunological biomarkers as measured in the blood, genetic biomarkers and mucosal biomarkers as measured in biopsy and monitoring of produced cytotoxic or genotoxic compounds in the colon (faecal) content.

A human dietary intervention study is the heart of the SYNCAN project. This is supported by an in vitro part to study the pre/probiotic interactions and by a rat study in order to get more insight in mechanisms. Samples originating from these experimental lines are sent to the BIOMARKER network for analysis. The biomarker work involves further optimisation of methodology and performing analysis of samples. 

LITERATURE REFERENCES
•	Abrams SA, Griffin IJ (2000) Calcium absorption is increased in adolescent girls receiving enriched inulin. Presentation on the World congress of paediatric gastroenterology hepatology and nutrition, Boston,, August  5-9 2000.
•	Brighenti F, Casiraghi MC, Canzi E, Ferrari A. (1999) Effect of consumption of a ready-to-eat breakfast cereal containing inulin on the intestinal milieu and blood lipids in healthy male volunteers. Eur. J. Clin. Nutr. 53(9):726-733
•	Coudray C, Bellanger J, Castiglia - Delavaud C, Rémésy C, Vermorel M, Rayssiguier Y (1997) Effect of soluble or partly soluble dietary fibres supplementation on absorption and balance of calcium, magnesium, iron and zinc in healthy young men. Eur. J. Clin. Nutr., 51(6):375-380.
•	Davidson M.; Maki K.; Synecki C.; Torri S.A.; Drennan K.B. (1998), "Effects of dietary inulin on serum lipids in men and women with hypercholesterolemia", Nutrition Research, vol.18(3), pp.503-517.
•	Den Hond,EM, Geypens B,Ghoos Y (2000) Effect of high performance chicory inulin on constipation. Nutrition Research 20(5),731-736.
•	Ellegård L, Andersson H, Bosaeus I (1997) Inulin and oligofructose do not influence the absorption of cholesterol, and the excretion of cholesterol, Fe, Ca, Mg, and bile acids but increases energy excretion in man. A blinded, controlled cross-over study in ileostomy subjects. Eur. J. Clin. Nutr.,51:1-5.
•	Jackson KG.; Taylor GR.; Clohessy A., Williams C.M. (1999), “The effect of the daily intake of inulin on fasting lipid, inulin and glucose concentrations in middle-aged men and women”. Brit. J. Nutr., vol. 82(1), pp. 23-30.
•	Kruse,HP, Kleessen B Blaut M (1999) Effects of inulin on faecal bifidobacteria in human subjects. Br. J. Nutr.82(5):375-382.
•	M.Verghese, D.R. Rao, C.B. Chawan, L.L. Williams and L. Shackelford (in the press, B) Dietary inulin suppresses azoxymethane-induced aberrant crypt foci and colon tumors at the promotion stage in Fisher 344 rats. J. Nutr.
•	M.Verghese, D.R.Rao, C.B. Chawan and L. Shackelford (in the press, A) Dietary inulin suppresses azoxymethane-induced preneoplastic aberrant crypt foci in mature Fisher 344 rats. J. Nutr
•	Pierre F, Perrin P, Champ M, Bornet F, Meflah K, Menanteau J (1997) Short-chain fructo-oligosaccharides reduce the occurrence of colon tumors and develop gut-associated lymphoid tissue in min mice. Cancer Research Vol 57, pp. 225-228
•	Reddy D.S.; Hamid R.; Rao C.V. (1997), "Effect of careinogenesis oligofructose and inulin on colonic preneoplastic aberrant crypt foci inhibition", vol.18(7), pp. 1371-1374.
•	Roberfroid M.; Van Loo J.; Gibson G. (1998), "The Bifidogenic nature of chicory inulin and its hydrolysis products", J. Nutr., vol.128(1), pp.11-19.
•	Rowland I.R., Rumney C.J., Coutts J.T., Lievense L. (1998), "Effects of Bifidobacterium longum and inulin on gut bacterial metabolism and carcinogen induced aberrant crypt foci in rats”. Carcinogenesis, vol.19(2) pp. 281-285.
•	Saavedra,J. M.; Tschernia,A.; Moore,N.; Abi-Hanna,A.; Coletta,F.; Emenhiser,C. &  Yolken,R. H. (1999) Gastro-intestinal function in infants cosuming a weaning food supplemented with oligo-fructose, a prebiotic. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., vol. 29(4); pp. A95
•	Taper H., Delzenne N., Roberfroid M.B. (1997), "Growth inhibition of transplantable mouse tumours by non digestible carbohydrates", mt. J. Cancer, vol.71, pp. 1109-1112.
•	Taper H.; Lemort C.; Roberfroid M. (1998); "Inhibition effect of dietary inulin and oligofructose on the growth of transplantable mouse tumor". Anticancer Research vol., 18; pp. 4123-4126.
•	Taper,H. S.;  Roberfroid,M. (1999) Influence of inulin and oligofructose on breast cancer and tumor growth The Journal of Nutrition, vol. 129(7 S); pp. 1488S-1491S.
•	Taper,H. S.;  Roberfroid,M. R. (2000) Inhibitory effect of dietary inulin or oligofructose on the development of cancer metastases Anticancer Research Accepted for publication.
•	Tschernia,A.; Moore,N.; Abi-Hanna,A.; Yolken,R. H.; Coletta,F.; Emenhiser,C. &  Saavedra,J. M. (1999) Effects of long-term consumption of a weaning food supplemented with oligofructose, a prebiotic, on general infant health status J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., vol. 29(4); pp. A58
•	Van den Heuvel E.; Muys T.; Van Dokkum W., Schaafsma G. (1999); Oligofructose stimulates calcium absorption in adolescents. Am. J. Clin. Nutr., vol.69, pp. 544-548.
•	Van Loo J.; Coussement P.; De Leenheer L.; Hoebregs H.; Smits G. (1995), "On the presence of inulin and oligofructose as natural ingredients in the Western diet", Critical reviews in food science and nutrition, vol.35 (6), pp. 525-552.
•	Van Loo J.; Cummings JH.; Delzenne N.; Englyst HN.; Franck A.; Hopkins MJ.; Kok N.; Macfarlane GT.; Newton DF.; Quigley ME.; Roberfroid MR.; van Vliet T.; Van den Heuvel EGH. (1999)"; Functional food properties of non digestible oligosaccharides : a consensus report from the ENDO project (DGXII AIRII-CT94-1095)", Brit. J. Nutr., vol.81, pp.121-132.

WOLFGANG KNEIFEL
OPRACOWYWANIE NOWYCH PRODUKTÓW, A KRYTERIA JAKOŚCI PRE-, PRO- I SYNBIOTYKÓW.

Department of Dairy Research & Bacteriology,
University of Agricultural Sciences
Gregor Mendel-Str. 33
A-1180 Vienna, Arustria
tel. + 43-1-47654-6103
Fax + 43-1-47654-6122
e-mail: kneifel@edv1.boku.ac.au

	Dzisiaj pro-, pre- i synbiotyki reprezentują ważną kwestię w dziedzinie żywności funkcjonalnej, której potwierdzeniem są ich właściwości prozdrowotne. Poza wartością odżywczą, ta nowa kategoria żywności charakteryzuje się  odpowiednio zbalansowanym składem, co przyczynia się do lepszego funkcjonowania ciała ludzkiego, w tym do  zapobiegania i leczenia chorób. Innymi słowy,  żywności funkcjonalna jest projektowana i wytwarzana w celu oszacowania korzystnych oddziaływań, poza normalnymi składnikami i właściwościami żywności. Rezultatem tej strategii w ostatnich 5 latach, jest wytwarzanie rozmaitej żywności funkcjonalnej, zarówno produktów mniej lub więcej wzbogacanych, jak też zupełnie nowych, spełniających oczekiwania współczesnej nauki, jak i akceptowane przez konsumentów.
	Produkty mleczne zawierające bakterie kwasu mlekowego (LAB) jako żywe składowe odgrywają dominującą rolę w tym segmencie rynku. Pomimo dużej różnorodności mlecznych produktów fermentowanych, nadal stwarzających  znaczące możliwości  innowacji, które pozwalają dalej rozwijać tę dziedzinę. Dobroczynne zastosowanie LAB sięga początku ubiegłego stulecia. Jednak zainteresowanie probiotykami (krótka definicja: korzystne mikroorganizmy) w żywności wyraźne ożywiło się od wczesnych lat dziewięćdziesiątych. Chociaż probiotyki w paszy zwierzęcej są stosowane na szeroką skalę od lat siedemdziesiątych, ich zastosowanie nie jest dobrze znane żywieniowcom. W międzyczasie  Komisja Europejska wydała restrykcyjne regulacje dotyczące probiotyków w paszy dla zwierząt, z jednej strony ze względu na spektrum mikroorganizmów, w tym szeroko stosowanych w żywności, z drugiej, z powodu pojawiającego się problemu oporności probiotyków na antybiotyki.
	Innym rodzajem żywności funkcjonalnej są prebiotyki, które stymulują dobroczynną mikroflorę jelitową, w szczególności bifidobakterie. Prebiotyki stanowią interesującą alternatywę dla bakterii probiotycznych, a należą do heterogennej grupy błonnika pokarmowego (z rodzaju oligo- i polisacharydów). Są głównie pozyskiwane z roślin, ale także z serwatki i coraz częściej dodawane do produktów mleczarskich i innej żywności. Stosowane są w celu osiągnięcia tych samych korzystnych efektów, co probiotyki, poprzez wspomaganie równowagi mikrobiologicznej w jelitach, ale cukry prebiotyczne mogą także poprawiać walory sensoryczne i teksturę żywności, do której są dodawane, mają ponadto niską wartość kaloryczną. Naturalną koleją rzeczy było łączenie pro- i prebiotyków tworząc tak zwane synbiotyki, które mogą wywierać dwojakie korzystne działanie. Pomimo tych właściwości, zastosowanie prebiotyków musi być rozważone bardziej dogłębnie, jeśli chodzi o obserwowane reakcje na zastosowaną dawkę substancji. Ostatnie badania wskazują, że kilka substancji prebiotycznych może być wykorzystywanych przez wybrane szczepy probiotyczne, a przez inne nie. Jeśli produkty synbiotyczne mają być unowocześniane, zainteresowanie przede wszystkim powinno skupiać się na sprawdzeniu sposobów metabolizowania tych węglowodanów przez szczepy stosowane w produktach, aby uniknąć tworzenia mieszanin nie mających znaczenia zdrowotnego.
	Rozwój żywności funkcjonalnej nie tylko bierze pod uwagę przetwarzanie, ale także optymalizację technologiczną i właściwości sensoryczne. Dotyczy on też wzmacniania działania biofunkcjonalnego, które musi być udowodnione w badaniach klinicznych. Tylko te produkty, których właściwości są potwierdzone naukowo będą zaakceptowane w przyszłości jako funkcjonalne. W odniesieniu do aktualnej wiedzy na temat żywności probiotycznej, producenci powinni udowodnić, że produkt finalny (nie tylko zastosowane mikroorganizmy) wywiera pozytywne skutki. To oznacza, że nawet zmiany w recepturze produktu mogą wymagać ponownego potwierdzenia właściwości probiotycznych w innych badaniach klinicznych. Chociaż taka sytuacja może przyczynić się do podjęcia badań i promowania roli instytucji naukowych, można się spodziewać, że producenci żywności będą musieli obliczyć dokładnie swoje korzyści przed podjęciem decyzji o opracowywaniu produktów funkcjonalnych.
	Oszacowanie jakości żywności pro-, pre- i synbiotycznej jest ważnym zadaniem. Wiadomo, że musi być określona wyselekcjonowana liczba mikroorganizmów probiotycznych, ponieważ udokumentowano, że działanie probiotyczne może być osiągnięte tylko jeżeli produkt zawiera dużą liczbę specyficznych bakterii. Z tego powodu, podejmowane wysiłki muszą być skierowane na rozwijanie metod, dzięki którym możliwe jest oznaczenie bakterii probiotycznych wśród mieszanej mikroflory produktu. Po drugie potrzebna jest także identyfikacja szczepów w produkcie i zapewnienie, że te specyficzne mikroorganizmy mogą przeżyć w środowisku przewodu pokarmowego, co najmniej do tego miejsca w jelicie, w którym ujawnia się ich specyficzne działanie. Chociaż ta droga mikroorganizmów może być symulowana w warunkach in vitro (istnieje kilka reaktorów modelowych), prawdziwe zachowanie (in vivo) szczepów musi być ostatecznie badane w testach klinicznych.
	Innym tematem dyskutowanym głównie w odniesieniu do probiotyków w karmieniu zwierząt są ich właściwości oporności na antybiotyki. Pierwotnie rozważane je jako cechę pozytywną (niektóre oporne szczepy probiotyków mogą być wykorzystywane w terapii antybiotykowej), lecz istnieją dowody, że pewne czynniki oporności mogą być także przenoszone do niepożądanych mikroorganizmów drogą różnych mechanizmów molekularnych. Dlatego producenci składników pasz probiotycznych muszą upewnić się, że ich szczepy nie zawierają możliwych do przeniesienia czynników oporności na antybiotyki. Z powodu tej sytuacji, można oczekiwać, że ta oporność stanie się w przyszłości ważnym problemem w odniesieniu do mikroorganizmów w żywności.
	W tej prezentacji, poruszone wcześniej tematy będą przedstawione szczegółowo. Przytoczone zostaną przykłady i punkty dyskusyjne dotyczące generalnych zasad tworzenia nowych produktów probiotycznych, aspektów kontroli jakości, badań nad kombinacjami synbiotyków, technik symulacji przechodzenia mikroorganizmów przez przewód pokarmowy, czynników wskazujących na specyficzne ilościowe oszacowanie i techniki identyfikacji, czynników oporności antybiotykowej i innych aspektów bezpieczeństwa żywności.

WOLFGANG KNEIFEL
PRODUCT DEVELOPMENT AND QUALITY CRITERIA OF PRO-, PRE- AND SYNBIOTIC FOODS

Department of Dairy Research & Bacteriology,
University of Agricultural Sciences
Gregor Mendel-Str. 33
A-1180 Vienna, Austria
Tel. +43-1-47654-6103
Fax +43-1-47654-6122
e-mail: kneifel@edv1.boku.ac.at

Today, pro- pre- and synbiotic foods represent an important issue within the the area of functional foods, which are claimed to possess several health-relevant advantages. In addition to their basic nutritive value, this new food category contains a proper balance of ingredients that enhance the functions of the body, including helping us directly in the prevention and treatment of illness and disease. In other words, the area of functional foods has been created and designed to provide beneficial elements and effects, besides the normal composition and properties of food. Following this strategy, a broad variety of functional foods has been created during the last five years, ranging from more or less supplemented products to innovative ones, which meet both current scientific demands as well as consumer´s acceptance.
Dairy products containing lactic acid bacteria (LAB) as live components are known to play a dominant role in this market segment. In spite of the big diversity of fermented milks, these products still possess a considerable innovation potential, which allows further development of this area. The beneficial use of LAB has its roots in the beginning of the last century. However, probiotics (brief definition: beneficial micro-organisms) in foods undergo some pronounced revival since the early nineties. However, it is not well known among food scientists that another approach, probiotics in animal feeds, has been applied to a large extent even longer, approximately since the seventies. Meanwhile, the European Commission has published restrictive regulations for probiotics in animal feeds, on one hand, because the spectrum of micro-organisms therein used is much broader than in the food area, on the other hand also due to emerging problems with regard to antibiotic resistance properties. 
Another segment of the functional food area is covered by the so-called prebiotics, which stimulate some beneficial bacteria in the gut, in particular bifidobacteria. Prebiotics have been found to constitute an interesting alternative to probiotic bacteria and belong to the heterogeneous group of dietary fiber of oligo- and polysaccharidic nature. They are mainly of plant, but also of whey origin and increasingly incorporated into dairy products and other foods. Primarily aiming at the same beneficial effects as probiotics by supporting the microbial balance of the intestine, prebiotic sugars may also improve sensory and textural attributes when added to foods. Furthermore, they mainly are of low caloric value. It was quite obvious to combine pro- with prebiotics in so-called synbiotic products, which may exert a twofold beneficial effect. Despite these features, the application of prebiotics has to be considered more in depth, since dose-response side-effects have been discussed. Recent studies have shown that some prebiotic substances can be utilized by certain probiotic strains, but others not. Therefore it would be of interest first to screen the utilisation patterns of the sugars and strains in order to avoid non-relevant mixtures, if synbiotic products will be deveoped.
The development of functional foods does not only take into account processing factors, technologicical optimization and sensory  parameters. Moreover, it is based on meeting and enhancing certain biofunctional effects, which have to be demonstrated in clinical studies. Only those products will be accepted as functional ones in the future, which provide scientifically certified claims. According to a currently discussed expertise, with probiotic products the manufacturer should prove that the final product (not only the micro-organism used) exerts positive effects. This means that even changes in the formula of the product may result in a new need for having re-confirmed the effects in another clinical study. Although this situation might fertilize some research activities and promote the role of scientific institutions, it can be expected that food producers will have to calculate exactly their benefits before following their decision to develop functional products. 
Quality assessment of pro-, pre- and synbiotic foods has become an important task. One item is, that the selective enumeration of probiotic micro-organisms has to be accomplished, because it is well-documented that probiotic effects can only be achieved if the product contains high numbers of specific bacteria. For this reason, efforts have been made to develop methods which are capable of detecting the probiotic bacterial components within a mixed microflora population. Secondly, there is also a need to identify  the probiotic strain in the product and also to certify that this specific micro-organism can survive the gastrointestinal passage at least to that gut region where specific effects will be induced or exerted. While this journey of the micro-organisms can be simulated in in vitro model systems (there are several model reactors that have been introduced), the real in vivo behaviour of the strain has finally to be observed in clinical tests as well. 
Another topic mainly discussed with regard to probiotics in animal feeds  are their antibiotic resistance properties. Originally considered as a positive item (since some resistance of the strain may support its application accompanied by some antibiotic therapy), there is some evidence that certain resistance factors can also be transferred to non-desirable micro-organisms via different molecular mechanisms. Hence producers of probiotic feed components have to assure that their strains do not contain transferable antibiotic resistance factors. Due to this situation, it can also be expected that antibiotic resistance will become an important issue in the area of food-related micro-organisms in the future.
In this presentation, the above mentioned topics will be introduced in detail, and the following examples and discussion points are dealt with:
General principles of probiotic food product development, aspects of quality control, research on synbiotic combinations, simulation techniques of the gastrointestinal passage of micro-organisms, factors related to specific enumeration and identification techniques, antibiotic resistance factors and other safety aspects.

DANUTA KOŁOŻYN-KRAJEWSKA
BEZPIECZEŃSTWO ZDROWOTNE ŻYWNOŚCI FUNKCJONALNEJ ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM PROBIOTYKÓW

dr hab. D. Kołożyn-Krajewska, prof. SGGW, Wydział Nauk o Żywieniu Człowieka i Konsumpcji, SGGW, ul. Nowoursynowska 159C, 02-787 Warszawa

Wprowadzenie
W ostatnich latach obserwuje się duży rozwój produkcji i propagowania spożycia grupy żywności, nazywanej z języka angielskiego żywnością funkcjonalną („functional food”) [2, 3, 9], dla której w języku polskim proponuje się między innymi nazwę „żywność pro-zdrowotna”. 
 „Żywność może być uznana za funkcjonalną, jeśli udowodniono jej korzystny wpływ na jedną lub więcej funkcji organizmu ponad efekt odżywczy, który to wpływ polega na poprawie stanu zdrowia oraz samopoczucia i/lub zmniejszeniu ryzyka chorób. Żywność funkcjonalna musi przypominać postacią żywność konwencjonalną i wykazywać korzystne oddziaływanie w ilościach, które oczekuje się, że będą normalnie spożywane z dietą – nie są to tabletki ani kapsułki, ale część składowa prawidłowej diety” [12]
Wg jedynej prawnie usankcjonowanej definicji Japońskiego Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej [4]: „Żywność funkcjonalna to produkty o działaniu sprzyjającym zdrowiu człowieka, stworzone na podstawie wiedzy o zależnościach między pokarmem, jego składnikami a zdrowiem; żywność, używana dla celów zdrowotnych, po spożyciu której można oczekiwać uzyskania takiego właśnie efektu zdrowotnego”. W ogólnym znaczeniu tego rodzaju produkty nie miałyby pełnić roli lekarstwa lecz być stosowane  jako część codziennej diety i traktowane jako żywność ogólnego spożycia.
Podwyższona jakość zdrowotna żywności funkcjonalnej wynika głównie z obecności w jej składzie substancji bioaktywnych, stymulujących pożądany przebieg przemian metabolicznych oraz z optymalnej fizjologicznie proporcji poszczególnych składników. Korzystne oddziaływanie zdrowotne tej żywności powinno być udokumentowane badaniami klinicznymi prowadzonymi na ludziach, do diety których włączono badany produkt żywnościowy. Ponadto konieczna jest także ocena bezpieczeństwa tych produktów żywnościowych. Badania te powinny być prowadzone przez niezależne ośrodki naukowe, obejmować odpowiednio dużą grupę osób i trwać wystarczająco długo, by zapewnić obiektywne i stabilne rezultaty. 
Do produkcji żywności funkcjonalnej stosowane są bioaktywne składniki żywności o rozpoznanych korzystnych właściwościach zdrowotnych: błonnik pokarmowy, oligosacharydy, poliole – alkohole wielowodorotlenowe, aminokwasy, peptydy, białka, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, witaminy, składniki mineralne, cholina i lecytyna, bakterie fermentacji mlekowej, substancje fitochemiczne.

Bezpieczeństwo mikrobiologiczne żywności funkcjonalnej

Problem zagrożeń mikrobiologicznych i szacowania ryzyka zdrowotnego dotyczy żywności funkcjonalnej w tym samym, a czasem nawet większym stopniu niż innych grup żywności. Bezpieczeństwo i trwałość żywności funkcjonalnej, z jednej strony ze względu na modyfikację składu, a z drugiej na potencjalne zastosowanie w żywieniu konsumentów wysokiego ryzyka, powinny być kontrolowane (opanowane) w sposób jak najbardziej efektywny.
Identyfikuje się dwa podstawowe zagrożenia związane z obecnością mikroorganizmów w żywności. Organizmy saprofityczne, jeśli rozwiną się w dużej liczbie, powodują pogorszenie jej cech smakowych i zapachowych, a w końcu całkowite jej zepsucie. Zużywanie przez drobnoustroje składników odżywczych wpływa na obniżenie wartości odżywczej żywności (rys.1). 
Z kolei organizmy chorobotwórcze mogą wywoływać zatrucia pokarmowe groźne dla zdrowia lub życia. Ryzyko zatrucia mikrobiologicznego związanego z konsumpcją produktów żywnościowych zależy z jednej strony od rodzaju i liczby mikroorganizmów lub ilości produkowanych przez drobnoustroje toksyn, obecnych w spożywanej żywności, z drugiej zaś od podatności organizmu człowieka na tego typu czynniki. Tak więc przy analizie ryzyka należy z jednej strony posługiwać się wiedzą mikrobiologiczną, dotyczącą możliwości występowania w danym produkcie żywnościowym potencjalnie niebezpiecznych mikroorganizmów, a z drugiej - wiedzą medyczną określającą liczbę mikroorganizmów i ilość toksyn, które mogą wywołać zakażenie lub zatrucie [1]. Czynnikami wpływającymi na zmianę epidemiologii zatruć i zakażeń pokarmowych są rodzaje spożywanych przez ludzi produktów żywnościowych, ich źródła i zmiana preferencji konsumentów w stronę żywności o niskim stopniu przetworzenia (sposób żywienia).  Do tej listy można jeszcze dodać wzrost popularności spożywania posiłków poza domem, a więc wzrost znaczenia żywienia zbiorowego [7, 8].
Jednocześnie stosowanie do różnorodnych produktów żywnościowych, odpowiednich kultur drobnoustrojów (najczęściej są to bakterie kwasu mlekowego – LAB), powoduje z jednej strony efekt utrwalający wywołany produkcją substancji o działaniu antymikrobiologicznym i/lub obniżeniem pH, a z drugiej poprawę wartości żywieniowej przez bakterie probiotyczne.
Ze względu na jakość mikrobiologiczną czyli zagrożenia i korzyści związane z rozwojem mikroorganizmów, podzielono produkty należące do żywności funkcjonalnej na następujące grupy: 
1.	Produkty wzbogacone w składniki korzystne dla zdrowia.
2.	Produkty o obniżonej zawartości składników niepożądanych. 
3.	Produkty uzyskane w wyniku zmodyfikowanych technologii wytwarzania (w tym utrwalania).
4.	Produkty probiotyczne, zawierające bakterie kwasu mlekowego (LAB).
Oddziaływanie mikrobiologiczne (szkodliwe i korzystne) i ewentualne możliwe do zastosowania działania zapobiegawcze w stosunku do ww. grup żywności funkcjonalnej zestawiono w tabeli 1.
Produkty w których ze względu na korzystne efekty żywieniowe zwiększono zawartość pewnych składników np.: błonnika, niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych, białek, witamin, substancji mineralnych itp., stanowią także bogatszą „pożywkę” dla mikroorganizmów. Zwiększenie ilości składników odżywczych sprzyja rozwojowi drobnoustrojów lub stanowi wręcz źródło nowych grup mikroorganizmów np. wzbogacenie produktu w błonnik pokarmowy dodawany w postaci otrąb (pszennych, sojowych itp.), zwiększa zagrożenie związane z rozwojem grzybów strzępkowych [8].  Konieczna jest więc modyfikacja procesów technologicznych głównie ze względu na stosowane metody utrwalania, które muszą być przystosowane do zmienionych warunków w żywności. Także oszacowanie bezpiecznego, z punktu widzenia zagrożeń zdrowotnych, okresu przydatności do spożycia musi być przeprowadzone ponownie.
Niektóre ze składników wzbogacających mogą mieć korzystne z punktu widzenia mikrobiologicznego, działanie. Związane jest ono z wprowadzaniem bakterii kwasu mlekowego i np. oligosacharydów stanowiących prebiotyki umożliwiające rozwój mikroflory probiotycznej. 
Wytwarzanie produktów żywnościowych o obniżonej zawartości składników żywieniowo niepożądanych lub których ilość w diecie powinna być, szczególnie dla osób z pewnymi schorzeniami, niewielka – powoduje technologiczną konieczność zastąpienia ich innymi składnikami. Dotyczy to np. tłuszczu, który może być zastąpiony  wielocukrem inuliną. Zmiana składu i zastąpienie pewnych składników innymi, może powodować większe ryzyko rozwoju niekorzystnej mikroflory np. w przypadku większej ilości wody. Podobnie jak w pierwszej grupie żywności funkcjonalnej, niektóre substytuty mogą być prebiotykami [13]. 
W przypadku produktów uzyskanych w wyniku zmodyfikowanych technologii wytwarzania, istnieje niebezpieczeństwo zastosowania nieprawidłowych lub nieskutecznych metod utrwalania, a tym samym niebezpieczeństwo rozwoju innych i „nowych” patogenów. Np. zastosowanie przechowywania w atmosferze modyfikowanej lub pakowanie próżniowe, stwarza niebezpieczeństwo rozwoju względnie beztlenowej bakterii Yersinia enterocolitica lub produkcji toksyn przez beztlenową Clostridium botulinum. Dotyczy to przede wszystkim żywności minimalnie utrwalonej, gdzie istnieje konieczność zastosowania technologii utrwalania kombinowanego („technologia płotków”). We wszystkich omówionych powyżej grupach żywności funkcjonalnej polecane jest opracowywanie i zastosowanie efektywnych mikrobiologicznych modeli wzrostu, inaktywacji i przeżywalności drobnoustrojów [7, 8].
	Czwartą, wyróżnioną z punktu widzenia jakości mikrobiologicznej, grupą żywności funkcjonalnej są produkty probiotyczne, zawierające bakterie kwasu mlekowego, których działanie jest korzystne zarówno ze względu bezpieczeństwa mikrobiologicznego żywności jak i zapobiegania rozwojowi mikroflory niekorzystnej w przewodzie pokarmowym człowieka.
Wśród związków wytwarzanych przez bakterie kwasu mlekowego, hamujących rozwój mikroflory patogennej, za najistotniejsze uważa się kwasy organiczne, w tym szczególnie aktywny kwas octowy, ponadto aldehyd octowy, nadtlenek wodoru oraz substancje antybiotykopodobne czyli bakteriocyny. 
Bakteriocyny stanowią dużą grupę heterogennych substancji chemicznych, różniących się zarówno ciężarem cząsteczkowym, budową chemiczną, właściwościami biochemicznymi jak i zakresem aktywności i sposobem działania na drobnoustroje. Jednym, z głównych producentów bakteriocyn są szczepy należące do gatunku Lactobacillus acidophilus, syntetyzujące bakteriocyny o dosć szerokim spektrum aktywności., hamujące między innymi bakterie chorobotwórcze z gatunków Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa czy Mycobacterium spp. [5,6; 10]. 

Bezpieczeństwo zdrowotne żywości probiotycznej

Wprawdzie bezpieczeństwo tradycyjnie wykorzystywanych bakterii fermentacji mlekowej nigdy nie było kwestionowane, ale stosowane od niedawna izolaty bakterii jelitowych takich jak: Bifidobacterium, Lactobacillus i Enterococcus, oferowanych konsumentowi w dużej liczbie jako probiotyk, wzbudziły obawy o bezpieczeństwo. W dokonanym przez Salminena i wsp. [11] przeglądzie danych dotyczących bezpieczeństwa Lactobacillus i Bifidobacterium wykazano, że możliwości patogenne tych bakterii są bardzo małe. 
Nieporównanie większe jest zagrożenie zdrowotne ze strony enterokoków. Bakterie te są potencjalnie patogenne. Proponuje się więc wyłączenie enterokoków z grupy bakterii fermentacji mlekowej. 
Wydaje się, że istnieje konieczność ustanowienia przepisów prawnych dotyczących żywności probiotycznej obejmujących następujące zagadnienia [5]:
•	Sformułowanie kryteriów dla szczepów bakterii probiotycznych, prebiotyków  i produktów, które  je zawierają. Kryteria te zostały już opracowane, ale nie opublikowane.
•	Powinny zostać określone kryteria definiowania probiotyków i prebiotyków.
•	Przebadane probiotyki i prebiotyki mogą być znakowane ich żywieniową funkcją poprawy zdrowia.

Niektórzy uważają jednak, że ustanawianie tych specjalnych przepisów jest zbędne chociaż w ten sam sposób można sformułować argumenty przemawiające za ustanowieniem przepisów prawnych dotyczących probiotyków (tab. 2). 

Podsumowanie

	Żywność funkcjonalna czyli pro zdrowotna, ma w założeniu stanowić składnik codziennej diety. W związku z tym, że duża część produktów przeznaczona jest dla osób o obniżonej odporności (niemowląt i małych dzieci, osób w starszym wieku, chorych i rekonwalescentów itp.) musi być bezwzględnie bezpieczna zdrowotnie w tym także mikrobiologicznie. Pewne modyfikacje związane z wytwarzaniem produktów funkcjonalnych mogą stanowić zagrożenie z mikrobiologicznego punktu widzenia i wymagają efektywnego opanowania w całym cyklu produkcji i dystrybucji. 
Z drugiej strony grupa produktów probiotycznych z dodatkiem kultur bakterii kwasu mlekowego, jest naturalnie utrwalona i bezpieczna dla zdrowia konsumenta, a dodatkowo wywołuje korzystne z punktu widzenia bezpieczeństwa mikrobiologicznego efekty, w przewodzie pokarmowym człowieka. Zwiększa to bezpieczeństwo mikrobiologiczne nie tylko żywności, ale także żywienia człowieka.
Bakterie fermentacji mlekowej stosowano zanim jeszcze dowiedziano się o ich istnieniu. Ich żywieniowy i terapeutyczny wpływ na organizm człowieka został następnie zbadany i opisany. Obecnie otwiera się nowa era ich zastosowania – selekcjonowanie szczepów, których rola zdrowotna ma być szczególna z żywieniowego i zdrowotnego punktu widzenia. 
Niewątpliwie temat probiotyków i prebiotyków jest obecnie „najmodniejszym” zagadnieniem badawczym na całym świecie. Realizowane są projekty naukowe o szerokim ogólnoeuropejskim, a nawet światowym zasięgu. 
Na pierwszym miejscu zastosowania probiotyków, powinno się jednak znaleźć kryterium bezpieczeństwa zdrowotnego. Zastosowanie niektórych szczepów bakterii uznanych za probiotyczne może być dość dyskusyjne. Dlatego dalsze badania dotyczące zapewnienia bezwzględnego bezpieczeństwa zdrowotnego żywności probiotycznej powinny być kontynuowane. 

LITERATURA

1.	Baird-Parker microbiological safety of food. Food Control, 6, 1 
2.	Goldberg I.: Functional foods for health – the current state and future prospects. Vitafoods International Conference, Copenhagen, March 11 – 13, 1997 
3.	Hasler C.M.: Functional Foods: Their role in disease prevention and health promotion, Food Technol., 52, 1998, 63
4.	Heasman M.: The regulation of functional foods and beverages in Japan, Vitafoods International Conference, Copenhagen, March 11 – 13, 1997 
5.	Jack R.W., Tagg J.R., Ray B.: Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Microbiol. Rev. 59, 1995,171
6.	Klaenhammer T.R.: Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie, 70, 1995, 337
7.	 Kołożyn-Krajewska D., 1998: Studium zapewnienia jakości żywności w aspekcie bezpieczeństwa zdrowotnego na przykładzie wybranych produktów mięsnych. Fundacja Rozwój SGGW, Warszawa
8.	 Knorr D. : Technology aspects related to microorganisms in functional foods. Trends Food Sci. Technol., 9, 1998, 295
9.	Kok J., Holo H., Van Belkum M.J., Haandrikman A.J., Nes I.F.: Nonnisin bacteriocins in Lactococci: Biochemistry, genetics, and mode of action. W: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria (Eds D.G. Hoover& L.R. Steenson) Academic Pres, Inc. New York, 1993
10.	Kurmann J.A., Rasic J.Lj.: Technology of fermented special products. Bulletin of the International Dairy Federation (IDF), 227, 1988,  101
11.	Salminen S., von Wright A., Morelli L I wsp.: Demonstration of safety of probiotics – a review. Int. J.Food Microbiol., 12998, 44, 93
12.	Scientific concepts of functional foods in Europe consensus document. Br. J. Nutr., 81, (Supl.        1), 1999, 1
13.	 Zychowicz  C., Surażyńska A., Siewierska B., Cieplińska T.: Effect of Lactobacillus acidophilus cultures (acidophilus milk) on the carrier state of Shigella and Salmonella organisms in children. Ped. Pol., 49, 1974, 997

														

JAKOŚĆ
MIKROBIOLOG.
ŻYWNOŚCI 

ŻYWIENIE
CZŁOWIEKA 

TOKSYNY,
METABOL. 

ZUŻYWANIE
SKŁ. ODŻ. 

ROZKŁAD
SUBST. 

POPRAWA WARTOŚCI ODŻYWCZEJ
(PROBIOTYK) 

NIŻSZA
WART.ODŻ. 

NIŻSZA JAK.SENS. 

BAKTERIE
KWASU
MLEKO-WEGO 

MIEJSCE 
SPOŻYW. 

SPOSÓB
ŻYWIENIA 

GRUPY
LUDNOŚCI 

"NOWE"
PATOGENY 

WZROST
ŻYW.ZBIOR. 

PODATNOŚĆ ORGANIZMU 

     ROZWÓJ MIKROORGANIZMÓW 

	

														

														

														

														

														

														

														

														
		
ZATRUCIA
POKARM. 

														

														

														

Tabela 1
Żywność funkcjonalna w aspekcie zagrożeń i korzyści mikrobiologicznych

Grupy żywności funkcjonalnej	Oddziaływanie mikrobiologiczne	Możliwe do zastosowania działania zapobiegawcze	

1. Produkty wzbogacone w składniki korzystne dla zdrowia np.: błonnik, NNKT, peptydy, białka, witaminy, substancje mineralne,

oligosacharydy, bakterie kwasu mlekowego	
Zwiększenie ilości składników odżywczych sprzyjających rozwojowi mikroorganizmów lub stanowiących źródło nowych grup drobnoustrojów.

Prebiotyki i synbiotyki	
Modyfikacja procesu technologicznego, przede wszystkim zastosowanie nowych metod utrwalania.
Prawidłowe oszacowanie okresu trwałości

2. Produkty o obniżonej zawartości składników niepożądanych
	Zmiana składu, zastąpienie pewnych składników innymi, powodującymi większe ryzyko rozwoju mikroorganizmów (np. wzrost zawartości wody).
Niektóre substytuty są prebiotykami	Jw., oraz prognozowanie bezpieczeństwa mikrobiologicznego produktów w zależności od modyfikacji	
3. Produkty uzyskane w wyniku zmodyfikowanych technologii wytwarzania, w tym utrwalania np.: minimalnie utrwalone
	Niebezpieczeństwo zastosowania niewystarczających przeszkód dla rozwoju drobnoustrojów.
Niebezpieczeństwo rozwoju innych i „nowych” patogenów	Konieczność zastosowania technologii „płotków” i efektywnego szacowania możliwości rozwoju drobnoustrojów	
4. Produkty probiotyczne, zawierajęce bakterie kwasu mlekowego (LAB)
	Wytwarzanie bakteriocyn i innych substancji o działaniu antymikrobiologicznym.
W przewodzie pokarmowym człowieka, zapobieganie rozwojowi mikroflory niekorzystnej w tym patogennej	Dodatek prebiotyków	
Akapity zacieniowane oznaczają korzystne działanie mikrobiologiczne
Źródło: opracowanie własne 

Tab. 2. Argumenty za i przeciw ustanawianiu specjalnych przepisów prawnych dotyczących probiotyków
Argumenty przeciw ustanawianiu specjalnych przepisów prawnych dotyczących probiotyków	Argumenty za ustanowieniem specjalnych przepisów prawnych dotyczących probiotyków	
•	Żywność fermentowana z zawartością żywych mikroorganizmów nie różni się zasadniczo od probiotycznej
•	Określenie probiotyk nie musi być definiowane
•	Zastosowanie mikroorganizmów w żywności jest uregulowane w istniejących przepisach dotyczących żywności
•	Znakowanie stosowanych mikroorganizmów jest uregulowane w istniejących normach i dyrektywach w sprawie znakowania
•	Substancje nie trawione i ich zastosowanie podlegają pod istniejące już prawo żywnościowe
	•	Produkty probiotyczne różnią się od innych fermentowanych z dodatkiem żywych mikroorganizmów
•	Określenie probiotyk może być stosowane nieprawidłowo i wprowadzać w błąd konsumentów
•	Mikroorganizmy są selekcjonowane ze względu na swoje specyficzne właściwości, poza ich funkcją technologiczną
•	Konsument powinien być poinformowany o właściwościach probiotycznych wyselekcjonowanych szczepów bakterii
•	Kryteria definiowania szczepów bakterii probiotycznych i produktów wymagają kontroli przez autorytatywne służby
•	Twierdzenie probiotyk lub prebiotyk stwarza korzyści marketingowe
•	Substancje nie trawione są selekcjonowane specjalnie ze względu na ich wpływ na wybrane bakterie, a nie ze względów technologicznych czy żywieniowych
•	Bezpieczeństwo zdrowotne probiotyków	

DANUTA KOŁOŻYN-KRAJEWSKA
SAFETY ASSURANCE OF PROBIOTIC AND OTHER FUNCTIONAL FOOD PRODUCTS

All foods are functional, as they provide taste, aroma and nutritive value. Within the last decade, however, the term functional as it applies to food has adopted a different connotation – that of providing an additional physiological benefit beyond that of meeting basic nutritional needs. 
The anti-microbial properties of the LAB can improve the microbiological quality of food, as LAB inhibit the growth of most foodborne bacterial pathogens. Lactic acid bacteria are used as silage inoculates to enhance the fermentation and reduce risk of spoilage. LAB are also important for human and animal health. Some strains have beneficial properties when used as probiotics in human nutrition.
Increasing the human consumption of probiotics and prebiotics appears to be safe. However bioactive proteins in small amount can be strong potentiators in biological systems: e.g. the action of botulinum and staphylococcal toxins. Also changing of product components can be reason of microbiological risk increasing. 
Future research activities need to concentrate on the integration of raw materials, microbial systems, processing, distribution, storage, preparation and consumption in order to better understand and monitor microbial viability as well as product functionality. Predictive food microbiology can help in solving these problems.